共焦显微镜杂记.docVIP

共焦顯微鏡雜記 王義閔 國立中山大學物理系研究生 魏良安 國立中山大學物理系大學生 高甫仁 國立中山大學物理系副教授 一、光學顯微鏡之發展 光學顯微鏡自問世以來，已歷經了四百年的演變，對於近代科學的發展有極大的影響。其演進的原動力，來自於人們想清楚地看到肉眼無法分辨之微小物體。於十六世紀，光學放大僅靠單一凸透鏡完成，但它的製作也導致了顯微鏡的發展。顯微鏡歷史上有許多著名的人物，但關於第一台顯微鏡的濫觴，就不得不提到Antony van Leeuwenhoek。他將小玻璃球拋光成一片透鏡（放大率約為270倍），並利用此透鏡做出世界上第一台實用的顯微鏡，在他多產的一生，他建造了約四百台的顯微鏡。由於他只使用單獨一片透鏡，所以Leeuwenhoek的顯微鏡被歸類為單一透鏡顯微鏡。現今所謂的『光學顯微鏡』一般指複合式顯微鏡，是由目鏡及物鏡所組成。十七世紀時，英國人Robert Hooke即利用自行製作的複合式顯微鏡發現了生物是由細胞所組成。十九世紀時，顯微鏡的發展已有長足的進步，並奠立了現今顯微鏡的規格，例如Carl Zeiss致力於顯微鏡的製作、Ernst Abbe提出了顯微光學原理的理論基礎及Otto Schott對光學玻璃詳盡的研究。時到今日，顯微鏡的種類與用途已包羅萬象，而顯微觀測技術也隨之增進，較重要且廣為使用的顯微技術包括暗視野（dark field）、相位對比（phase contrast）、差分干涉（differential interference contrast）、偏光（polarized light）、以及螢光顯微術（fluorescence microscopy）等。 二、螢光顯微術與生物醫學研究的關聯 顯微術對生物醫學發展的影響可謂是空前，但僅憑單純之空間解析度並無助於自生物樣品擷取太多有用之資訊，目前在許多生物樣品的觀測上，免疫螢光染色（immunofluorescent staining）可說是觀測某一特殊蛋白質在局部分布上最具廣泛用途和有效的方法。發特定螢光的染料常被『接至』（chemically bonded）一純化的特殊抗體（antibody）上，而此染料-抗體之複合分子則在樣品上尋找相對於此抗體之抗原（antigen）並結合。如此一來，藉螢光顯微成像即可顯示此一特殊蛋白質的分佈與位置（抗體、抗原皆屬蛋白質分子）。另一偵測特殊蛋白質的方法即為借助綠螢光蛋白質（Green Fluorescent protein, GFP）。此種蛋白質首在Aequoroa victoria水母上找到，它的分子量為238，在適當的波長激發下可發出綠色螢光。藉重組染色體的技巧（recombinant DNA）可將產生GFP的基因植入活體培養細胞之中，甚至整個生物的某部分細胞之中。如此，帶有並表現GFP基因之細胞即可在一片組織中被清楚地標定出來，而GFP蛋白質在細胞中的移動亦可清楚顯現。另外螢光影像亦可用於測定細胞質流體（cytosol）中自由鈣離子（Ca++）濃度。鈣離子在細胞之新陳代謝上扮演極重要之角色，如肌肉之收縮、訊息之傳遞等。 三、共焦顯微鏡之發展 由於傳統的光學顯微鏡受到光波繞射的限制，致使它無法提供無限的放大能力，其發展一度被宣告終止，且其成像方式依舊是停留在平面成像。傳統上，螢光染色之樣品係藉由螢光顯微鏡觀測，但由於景深之關係使得螢光顯微鏡無法僅觀測某一斷層，以致拍得之螢光影像常顯得一團模糊，無法區分染色的部位到底位於何處，比如在細胞膜上或是細胞內部，所以薄切片的製作技術便應運而生。但切片後則無法觀測活體樣品，且難以顯現樣品之原狀。這個難題直到共焦掃描顯微鏡發明後才得以解決。共焦掃描顯微的原理，一般咸認在1957年時已由Marvin Minsky提出，如圖一.所示，但由於當時缺乏適當的光源與數據處理的能力，使得這一原理仍停留在純理論之階段，共焦掃描顯微技術能真正 圖一. 共焦掃描顯微的原理，摘錄自Marvin Minsky所提出之美國專利，其編號為3,013,467。 成為一個實用的顯微技術則是等到雷射與個人電腦發明以後。在1969年時，Paul Davidovits和M. David Egger利用雷射發展了第一台共焦掃描顯微鏡，而第一台商業化的共焦掃描顯微鏡則是到1987年才問世。近十餘年來，無論是雷射技術或者是個人電腦都有著驚人的發展，使得共焦顯微技術更形完備。 單光子共焦顯微鏡的光學理論首由時在英國牛津大學的Colin Sheppard和Tony Wilson提出。美國康乃爾大學的Watt W. Webb等人則於1989年實驗上證實了雙光子共焦顯微鏡的獨特性，其設計圖如圖二.所示，並引起了相當大之震撼。隨後Colin Sheppard和Min Gu則提出了相對應之雙光子共焦顯微鏡的光學理論。但截至