重组DNA技术讲述.ppt

重组DNA技术 （二）工具酶 限制性核酸内切酶 DNA聚合酶Ⅰ 逆转录酶 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶 DNA连接酶 （三）目的基因 cDNA (complementary DNA) 基因组DNA (genomic DNA) 作为基因工程运载体的条件 （一）目的基因的获取 1. 化学合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。 2.基因组DNA文库(genomic DNA library) 3. cDNA文库(cDNA library) 4. 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) 五、重组体在宿主细胞中的表达和调控 基因工程的最终目的是通过载体将外源基因导入合适的宿主细胞中高效表达，产生有重要价值的蛋白质产品。 克隆基因表达条件：⑴ 基因的编码区不能被插入序列中断;⑵ 基因转录要有启动子，而启动子必须能被宿主 细胞的RNA聚合酶有效地识别;⑶ mRNA必须相当稳定，并有效地被翻译，产生的外 源蛋白质必须不为宿主细胞的蛋白酶所降解。 三、 重组技术在医学中的应用 产品名称 治疗功能与医药范围 1. 人胰岛素 治疗糖尿病 2. 人生长激素 治疗侏儒症，加速创口愈合 3. α干扰素 治疗癌症、病毒感染 4. β干扰素 治疗带状疱疹，眼结、角膜炎 5. γ干扰素 治疗癌症、病毒感染 6. 人组织纤溶酶原激活因子(tPA) 溶解血栓，治疗急性心肌梗塞 7. 红细胞生成素 (Epo) 治疗肾病性贫血，增加红细胞及血色素水平 8. 超氧化物歧化酶 清除超氧化物，治疗关节炎，缓解心肌坏死 9. 凝血因子Ⅷ 治疗A型血友病 10. 乙型肝炎疫苗 防治肝炎 11. 神经生长因子 维持神经元细胞存活、生长和分化 12. 脑啡肤 镇痛 13. 降钙素 治疗骨质疏松症 受体菌条件 安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态(competent) 导入方式 转化 (transformation) 转染 (transfection) 感染 (infection) （四）重组DNA导入受体菌 （五）重组体的筛选 1. 直接选择法 (1) 抗药性标记选择 (2) 标志补救(marker rescue) (3) 分子杂交法 原位杂交 Southern印迹 2. 免疫学方法 如免疫化学方法及酶免检测分析等 平板筛选 是指利用载体的遗传性标记在平板上直接筛选的方法。 具有抗药性标记的载体，转化宿主细胞后，能 在含抗生素（Amp或Tet）的培养平板上生长；未转 化的则不能生长。 插入失活 当外源DNA序列插入质粒中某一抗药基因内，使 该基因失活，转化细胞就不能生长在含相应抗生素的 培养平板上。 (插入失活法) 抗药性标记选择 目 2. 蓝-白筛选 利用蓝色化合物的形成作为指示剂，筛选带重组质粒的细菌。 载体：编码β-半乳糖 宿主： 编码β-半乳糖 苷酶N端序列 苷酶C端序列 α-互补 细菌表达： β-半乳糖苷酶活性↑ 5-溴-4-氯-3-吲哚（ X-gal） → 形成蓝色菌落 当在质粒中插入外源DNA→β-半乳糖苷酶的N端基因失活→ 不能与宿主β-半乳糖苷酶的C端进行α-互补→产生白色菌落。 （IPTG 存在下） 组氨酸缺陷 型大肠杆菌 无组氨酸 的培养基 酵母咪唑甘油磷 酸脱水酶基因 促进组氨酸合成 λDNA 重组体 标志补救 原位杂交 Southern印迹 目 录 小结：重组DNA技术操作的主要步骤 载体 质粒 噬菌体 病毒 目的基因（外源基因） 基因组DNA cDNA 人工合成 PC