实验PCR与琼脂糖凝胶电泳New.ppt

实验二 多聚酶链式反应（PCR）与琼脂糖凝胶电泳 一、实验目的 掌握PCR的基本原理及其基本操作技术 学习琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法 检测水稻总DNA的纯度与分子量 检测PCR的结果 多聚酶链式反应（PCR）是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的体外酶促合成反应。 由高温变性，低温退火和适温延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。 二、实验原理 1、PCR的原理 1）高温变性（94℃） ： 使DNA双螺旋的氢键断裂，双链DNA解离成单链DNA 2）低温退火（55℃）： 引物和其互补的模板链3’端结合，形成部分双链DNA 3）中温延伸（72℃）： 通过Taq DNA聚合酶使引物从5’端向3’端延伸，随着4种dNTP的掺入，合成与新的DNA互补链，完成第一轮变性、退火和聚合反应循环。 反复进行这一循环，可使两端引物限定范围内的DNA序列以指数形式扩增，循环的次数主要取决于模板的浓度，从理论上讲一个目的DNA分子经20次循环扩增后可达106。 实验原理 2、琼脂糖电泳原理 电泳是分离和纯化DNA片段的最常用技术。 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45℃ 开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。 电荷效应： DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。 实验原理 分子筛效应：不同的DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带，DNA的迁移速度与分子量的对数值成反比关系。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA,主要是利用分子筛效应, 因而就可根据DNA分子的大小使其分离。 该过程可以通过把示踪染料或分子量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。分子量标准参照物也可以提供一个用于确定DNA片段大小的标记。 Goodview可与DNA分子形成复合物，发射的荧光强度较游离的Goodview强度大10倍以上，且荧光强度与DAN含量成正比。 实验原理 DNA样品的纯度： 植物总DNA样品应呈现一条迁移率很小的整齐条带，表明所提样品较纯；若在溴芬蓝前有弥散的荧光区出现，则表明样品中含有RNA杂质；若所提总DNA在琼脂糖凝胶上不能形成清晰的条带，而只是弥散一片，则表明DNA已严重降解。 DNA分子大小： 与泳动距离相同的分子量标准参照物的DNA条带的分子量相近。 实验原理 凝胶种类 质量浓度（g/ml） DNA的分离范围（bp） 聚丙烯酰胺 20 5-100 15 20-150 5 75-500 3.5 100-1000 琼脂糖 2 100-5000 1.2 200-8000 0.8 400-20000 0.3 1000-70000 三、实验材料、用具及试剂 实验材料：水稻总DNA 对照品种：P1（9311，籼稻）、P2（台中65，粳稻） 待测品种 ：每小组7个水稻品种 实验器具：PCR仪，电泳仪，电泳槽，电子水平，移液器，枪头， 2ml离心管，0.2ml离心管，三角瓶，微波炉等 试剂：dNTP，引物一对（编号为22179）， Taq酶，10×PCR反应缓冲液， 灭菌双蒸水，琼脂糖，1×TBE电泳缓冲液， Goodview，载样缓冲液（Loading buffer） 10× PCR buffer： 500mM KCl 200mM Tris-HCl（pH8.3） 0.01% 明胶 （ gelatin ） 15-20mM MgCl2 1×TBE缓冲液（1000ml）：电场中的导体 载样缓冲液（6×）：含指示剂溴芬蓝和二甲苯青，可在 可见光下指示样品的泳动过程 Goldview：荧光颜料，插入DNA双链中，使DNA在 紫外光下显色 Tris 10.8 g 硼酸 5.5 g EDTA 0.93 g 溴芬蓝 0.25 % 二甲苯青 0.25 % 甘油 30 % DNA分子量标准 1、PCR反应混合液的制备（1个样品，总体积20 μl） 0.2 μl dNTP（10mM） 2.0 μl 10× PCR buffer（含15mM MgCl2） 0.2 μl