微生物代谢的人工控制.ppt

微生物代谢的人工调控 第一节 微生物代谢的人工控制简介 第二节 发酵工程流程 第三节微生物代谢的人工调控方法 第四节微生物的代谢途径修饰 改变代谢途径 扩展代谢途径 转移或构建新的代谢途径 第五节微生物代谢途径修饰的应用 第一节 微生物代谢的人工控制简介 微生物代谢的人工控制 一个崭新的科学领域,它综合了分子生物学、微生物学、分子反应动力学、生化工程等多个学科领域的最新成果,是目前国内外研究的热点； 代谢工程被视为继蛋白质多肽单基因表达的第一代基因工程、基因定向突变的第二代基因工程(即蛋白质工程)之后的第三代基因工程。 人工控制改造后自身效率提高实例 微生物代谢酶的活性调节 以酶分子结构为基础 指调节胞内已有酶分子的构象或分子结构来改变酶活性，从而调节所催化的代谢反应的速率的方式。是酶分子水平上的调节，属于精细的调节。 特点：作用直接、响应快、可逆 微生物代谢的人工控制实例 人工控制微生物代谢的目的—— 根据不同的菌种，应选择不同的原料配制培养基。配制的培养基应满足微生物在碳源、氮源、生长因子、水、无机盐等方面的营养要求，并为微生物提供适宜的PH。 培养基的营养要协调，以利于产物的合成。 培养基在满足微生物的营养的需求的基础上，应尽量降低生产成本，以得到更高的经济效益。 第三节 微生物代谢的人工调控方法 1 目的 最大限度的积累对人类有用的代谢产物 2 措施 改变微生物细胞膜的通透性 改变微生物的遗传特性（诱变、重组等） 控制发酵条件（如温度、PH、O2等） O2： 如：酵母菌在有氧条件下大量繁殖，在无氧条件下才大量产生酒精。 又如：谷氨酸棒状杆菌在溶氧不足时，生成的产物是乳酸或是琥珀酸。 C：N 如在谷氨酸发酵过程中，当培养基中C： N=4：1时，菌体大量繁殖而产生谷氨酸少；当C：N=3：1时，菌体繁殖受抑制而合成谷氨酸多 第四节 微生物的代谢途径修饰 代谢工程的目的 通过重组DNA技术构建具有能合成目标产物的代谢网络或具有高产能力的工程菌，并用于生产。 代谢工程研究的设计思路 1)提高通向目标产物的代谢流; 2)扩展代谢途径; 3)构建新的代谢途径 一、改变代谢途径 加速限速反应 改变分支代谢途径流向 构建代谢旁路 改变能量代谢途径 一、改变代谢途径，提高通向目标产物的代谢流 加速限速反应(通过关键酶的过量表达来解决代谢瓶颈) 将编码限速酶的基因通过基因扩增 ,增加拷贝数 ,在宿主中表达并增强催化限速反应的酶的表达量或活性,从而提高代谢流。以实现目的产物产率的上升。经典代谢工程主要过程: 首先 ,必须确定代谢途径中的限速反应及其关键酶。 然后 ,将编码限速酶的基因通过酶切等手段 ,制得特定片段 ,连接在高拷贝数的载体上再导入宿主中去表达,从而加速限速反应,提高目的产物产率。 在头孢霉素 C传统的发酵过程中 ,青霉素N的积累表明下一步酶反应是头孢霉素合成代谢中的限速步骤 ,通过克隆编码限速酶(脱乙酰基头孢霉素合成酶)基因 cefEF,再将该重组质粒导入头孢霉素 C生产菌株顶头孢( Cephalosporium acremonium)中 ,所得工程菌株的头孢霉素C的产量提高了25 %,而青霉素N的积累量减少了15倍。 改变分支代谢途径流向 在有竞争途径(如分支代谢途径)存在时,阻断有害的或无关的竞争代谢途径代谢产物的合成,从而达到改变代谢流,提高目标产物产量的目的。 高丝氨酸脱氢酶缺陷型(Hom2)赖氨酸工程菌 芳香族氨基酸合成 头孢烷酸中 ,色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸三条支路上的任一条支路的酶活性被加强 ,其与另两条支路的竞争将占据优势。日本 Katsumata Ryoichi 等人从谷氨酸棒杆菌 K86 中提取质粒 pCDtrp157 ,该质粒带有DAHP合成酶基因和色氨酸合成酶基因。将该质粒转化至谷氨酸棒杆菌 KY9182(Phe2) ,使该菌可产色氨酸1.1 gΠL。若将苯丙氨酸合成相关的酶基因如 pheA 的基因克隆 ,则可使色氨酸生产菌转化为苯丙氨酸生产菌。 构建代谢旁路 高密度培养技术在发酵生产中，为实现大肠杆菌的高密度培养,必须阻断或降低对细胞生长有抑制作用的有毒物的产生。大肠杆菌糖代谢末端产物乙酸达到一定浓度后明显造成细胞生长受抑制, 人们应用代谢工程的方法,将枯草杆菌的乙酰乳酸合成酶基 因克隆到大肠杆菌中,构建新的代谢支路,结果明显改变细胞糖代谢流,使乙酸处于较低水平,以实现高密度培养目的。 改变能量代谢途径 除了通过相关代谢途径的基因, 改变能量代谢途径或电子传递系统也可以有效改变代谢流。 重组木糖发酵菌株 SaccharomycescerevisiaeTMB3001可以在含木糖的培养基上生长,但其用木糖产乙醇率很低, 一个重要原因就是菌