生物催化剂的来源与筛选.ppt

第三章 生物催化剂的来源与筛选 大 纲 3．1 概述 3．2 微生物酶筛选的策略 3．3 微生物和酶的一般筛选方法 3．4 优良菌种选育 3．5 从环境中微生物基因组DNA筛选酶的方法 3．1 概 述 3．1．1 生物催化剂的概念 1 生物催化剂：是生物反应过程中起催化作用的游离或固定化酶的总称。 2 分 类 3．1．2 生物催化剂来源与多样性 3．1．3 生物催化剂的寻找和发现 提高筛选效率的基本原则 ①需要设计合适的用酶方法，使得目标反应非常清楚 ②需要在有希望的微生物中寻找具有合适活性的微生物 ③需要建立方便和敏感的分析系统尽可能多的搜寻微生物 3．2 微生物酶筛选的策略 3．2．1 常规生物催化剂筛选的一般策略 生物催化剂筛选的反应过程的设计 生物催化剂筛选的反应过程的设计 例：①生物法：腈水合酶与酰胺酶催化反应生产丙烯酰胺 酶或产酶微生物的筛选 一般产酶微生物筛选的原则 ①能够通过发酵在相对较短的时间内高产目标酶； ②微生物应该尽可能地利用便宜和方便的原料生产酶； ③微生物所产生的酶最好有比较高的专一性 ④所采用的微生物应该是不产生有害物质的非致病性的安全微生物 ⑤微生物的遗传稳定性应该比较高 生物催化剂筛选的主要途径 （1）从商品酶库中筛选 （2）从已知菌种来源和菌种保藏中心筛选生物催化剂 （3）从自然界发现和筛选产酶微生物 （4）从基因库筛选 3．2．2 从极端微生物中筛选极端酶的策略 极端酶（extremozyme） 是由极端微生物（extremophile）产生的酶，与之相对应的中间型是常态微生物（mesophilic organism）产生的酶。 如何进行极端酶的研究和开发 ①必须有足够的酶，这就涉及极端微生物的培养 ②依赖极端酶在中间宿主中的表达 表3-1 某些有应用前景的超级嗜高温酶 3．2．3 未培养生物催化剂的发现策略 未培养微生物（uncultured microorganism） 美国微生物学家Colwell的实验室在1982年首先提出“不能培养微生物（nonculturable microorganism）” 的概念，他们发现快速生长的霍乱弧菌和大肠杆菌移植到无营养料的盐水中，经长时期的低温保存后，细胞数不减，代谢活力不变，但在正常肉汤培养条件下不产生菌落，因此他们用“活的但不能培养（viable but nonculturable, VBNC)”一语描述这种潜伏状态的细菌。 3．3 微生物和酶的一般筛选方法 3．3．1从自然界发现产酶微生物 采样 富集培养：是根据微生物的生理特点，在目的微生物含量较少时，设计一种选择型培养基，创造有利的生长条件，是目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣种变成人工环境下的优势种。分为分批式（摇瓶培养）和恒化式（连续培养）两种不同的方式。 分离 筛选 图3-2 从自然界发现产酶微生物的方法 3．3．2 生物催化剂的高效筛选 高通量筛选（high-through screening, HTS）是近年来发展起来的一种新型筛选技术，其特点是微量、快速、灵敏、准确，在短时间内可以检测大量的微生物。 3．4 优良菌种选育 优良生产菌种应该具备的基本特点： ①生产菌种应该具备在较短的发酵周期内产生大量发酵物 ②在发酵过程中不产生或少产生与目标产品性质相近的反应产物或副产物，以便于分离纯化。 ③能利用多种来源的原材料，并对发酵原料成分的波动敏感性较小，可用价廉易得的原材料进行培养，以降低发酵成本。 ④对需要添加的前体物质（底物）有耐受力，并且不将底物、产物作为一般碳源利用。 ⑤具有抗杂菌污染，抗噬菌体感染的能力。 ⑥发酵泡沫少，利于提高装料系数、提高单罐产量、降低发酵成本 ⑦生长繁殖能力强，有较快的生长速率，遗传特性稳定。 3．4．1 自然选育 自然选育（spontaneous mutation）：未经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程。 复 壮 3．4．2 诱变选育 诱变育种的原理 表3-2 常用的各类诱变剂 诱变育种的基本方法 3．5 从环境中微生物基因组DNA筛选酶的方法 从土壤和水样中提取DNA 土样 → 分离去除细菌→ 分离收集DNA片段→ 用限制酶剪切DNA → PCR扩增→ 克隆到BAC载体内→ 转化培养微生物（大肠杆菌） → 筛选转化株→ 功能基因→ 新酶 土壤微生物DNA文库的构建 * * 结 构 形 式 细 胞 酶 多细胞生物体 游离型催化剂 固定化催化剂 设计反应过程 选择合适的酶或产酶微生物 建立有效且方便的分析方法 图3-1 海因