酶工程 第四节 酶分析法.pptVIP

第四节 酶分析 ? 酶分析是生化分析的重要内容，凡涉及到生化、医疗化验、生产实践和基础研究都离不开酶分析，酶本身分离纯化的每一步也要分析酶，特别是判断每一步效率。 ? 包括酶分析和酶法分析，两者检测对象不同，但其原理大致一样：都是利用酶的专一性、高效催化反应，通过酶反应速度的测定而检测相应的含量；在方法上也都有一个选择适宜反应条件和测定方法，以获得准确可靠的结果的问题。 酶分析 （Enzyme Assay） 以酶为分析对象，目的是检测食品、药物 体液等生物样品中酶的含量或活性； 如：血液中谷丙转氨酶、淀粉酶等测定； 葡萄糖氧化酶生产发酵液中葡萄糖氧化酶活 力测定等； 酶法分析（ENZYME ANALYSIS） 酶法分析是一种以酶为分析工具（分析试剂）的分析法，分析的对象可以是底物、辅酶、活化剂、酶抑制剂。主要用于测定与生物样品有关的样品中酶以外其他物质的含量。 常用于食品、药物、体液等样品中成分含量检测如血糖、胆固醇等测定。 一、酶分析 (即酶活力测定) （Enzyme Assay） 酶活力：是指酶催化一定化学反应的能力，其大小可用在一定条件下酶催化某一化学反应的反应速度来表示。（单位时间底物减少或产物增加） 一个酶单位（active unit, U，I.U）为在确定的最适反应条件下，每分钟催化1?mol(微摩尔）底物变化所需要的酶量。（国际酶委员会规定） 所以：酶的单位数与速度值数值上相等  （一）、测定原理： 测酶活力就是在确定的最适反应条件下测定酶促反应速度， 酶促反应速度取决于那些因素 ？ 　——速度方程　　 米氏方程 Michaelis Menten根据中间产物学说推 导出表示酶促反应中底物浓度与反应速度 关系的公式称为—— 米氏方程： 米氏方程的推导： 根据中间产物学说： 式中K1,K2,K3分别为各反应常数，可知： ES形成速度= K1 [E] [S] ES分解速度=(K2, + K3 ) [ES] 当反应达恒稳态时,二速度相等,即: K1 [E] [S] =(K2, + K3 ) [ES] 整理并令： 由于[E] 与[ES]之和为总的酶浓度[E0] , 即: [E0]= [E] +[ES] [E] = [E0]－[ES] 将③代入②: 整理得: ∵酶促反应速度由[ES]决定,而v= K3 [ES] ∴ [ES]= 将⑤代入④整理得: 当[S] 升高,所有E为S所饱和时,即: [E0] =[ES] 此时达到最大反应速度Vmax: Vmax= K3 [E0] ⑦ 将⑦代入⑥ 即为米氏方程 关于米氏方程的讨论 1、 Km ＞＞[S] 时： v=V[S]/ Km 初速度与[S]成正比的一级反应。 2、若Km [S]时： v=V 零级反应 3、若Km = [S]时： v=1/2V 米氏常数Km的意义 1、概念： 反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。 2、单位： mol/L 或 mmol/L 3、意义： ① Km是酶的特征性物理常数。 只与E性质有关，与[E]无关； 如：某一底物有几种酶，各有一定的Km值。 测Km可鉴别酶。 ② 同一E, 有几个S 就有几个Km， Km最小的为最适S或天然S。 ③ Km大，E 与S亲和力弱； Km小， E与S 亲和力强。 4、实际用途： 1）可由所要求的 V 求[S]； 例：求反应速度达最大反应速度99%时 的至少底物浓度 2）根据已知[S]求该反应V。