激光共聚焦(简化版).ppt

Intensity Before bleach After bleach 90 min after bleach 4. 荧光漂白恢复 (Fluorescence Recover after photobleaching; FRAP) 检测细胞连接间的信息传递 光漂白技术的基本原理是：使用强激光照射，将细胞内的一个区域内的荧光分子漂白，然后观察未漂白的荧光分子的运动。 GFP 是比较适合用于光漂白研究的荧光分子。 首先，它比较亮、稳定、在活细胞内没有毒性，在使用低激光强度拍摄图像时漂白较少。 其次，在使用高强度激光照射时，GFP的光漂白是非可逆的，并且 GFP 的光漂白不会造成细胞损伤。 分子融合技术将绿色荧光蛋白和特定蛋白分子融合，使得光漂白技术可以用于研究蛋白分子在细胞内的运动。 激发方式：单光子激发 观察方式：以荧光为主 光源：激光（紫外、可见光、近红外） 照明方式：点照明、逐点扫描 成像方式：共轭聚焦、逐点成像 输出：实时观测,数字化图像，可以进行图像处 理和定量分析 激光共聚焦扫描显微镜的基本特点 Leica TCS SP2双光子激光共聚焦扫描显微镜 激光波长：780－920nm；458nm、476nm、488nm、 514nm、543nm、633nm 显微镜：倒置显微镜 适用标本：培养细胞、固定组织切片 谢谢大家！ * * 随着显微镜和各种染色技术发展，使我们对大脑的微观结构了解的越来越多。并且发现大脑的功能基础是神经元网络。但是传统的免疫组织化学试验方法不能满足我们在同一组织上观察两个和两个以上蛋白的需要。因此荧光标记技术和荧光显微镜和激光共聚焦扫描显微镜的开发和广泛应用使我们能够同时观察多个目标。随着荧光探针技术的不断进步，现在应用不同的探针还能进行活组织和细胞的功能研究。 * 使用多荧光标记技术，可以研究细胞内蛋白分子在细胞器上的定位： 比如：研究蛋白分子在细胞骨架上、在细胞核内、在细胞膜上、在内质网、在高尔基体、在 Endosome 上的定位等等。 还可以使用荧光共振能量转移（FRET）的方法来研究共定位，如果发生 FRET，就表明两种蛋白分子之间的距离小于 10 nm。 还可以使用三维重构的方法来研究蛋白分子的定位。 * 荧光串色是指两种或多种荧光染料的发射光谱互相重迭的现象：当使用多种荧光染料标记标本时，或当标本具有很强的自发荧光时，很容易产生串色现象。 根据荧光染料的性质可将荧光串色分为二类： 第一类串色是：两个荧光染料的激发光谱没有重迭，但发射光谱有重叠。因为两种荧光染料的激发光谱不重迭，所以可以使用序列扫描的方法来排除串色的影响：即先使用第一种荧光染料的激发光扫描一张图像，再使用第二种荧光染料的激发光扫描第二张图像。 第二种串色是：两个荧光染料的发射光谱和吸收光谱都有重迭。使用光谱扫描的方法可以排除这类串色的影响。在后面会详细介绍光谱扫描方法。 * * 最简单的用来确定有无自发荧光的方法是使用与观察标记标本相同的仪器参数去观察一个未经染色的对照标本。 为了尽量排除荧光串色的影响，在实验中应注意以下几点： 尽量选择发射光谱较少重迭的荧光染料； 尽量选择吸收光谱较少重迭的荧光染料； 使用带通滤光片，将各个荧光染料的发射光分开； 使用只能激发一种染料的激光线来扫描标本，并采用序列扫描的方法； 确保每种荧光染料的标记强度是一致的，即：不要将一种颜色标的太强或太弱； 确保荧光信号比自发荧光要强； * 如图所示是使用序列扫描的方法排除荧光串色的例子： 使用 DAPI （蓝色）来标记细胞核、Cy2 （绿色）来标记 Na+/K+ ATPase、Alexa 568 phallodin （红色）来标记 F-actin。 未使用序列扫描的时，DAPI 的信号串到了 Cy2 通道，Cy2 的信号又串到了 Alexa 569 通道。 同一个标本使用序列扫描后，所有的颜色都被清楚的分开，排除了荧光串色的影响。 * 使用共聚焦显微镜可以在垂直于物镜光轴的平面上，通过一步步的改变物镜的聚焦平面采集一系列光切片，这被称为 Z-序列图片。 Z-序列图片可以用来对标本进行三维重构，也可将它们投射到一个平面上进行观察，研究标记分子的在细胞内的空间定位。 左图所示是细胞经基因转染后，使用 2-维 和 3-维 图像观察核内质粒 DNA 空间定位的实验： 用 acridine orange (吖啶橙) 标记细胞核和其它细胞结构，用罗丹明(红)标记质粒。 图像由 35 个光切片组成，每个光切片相隔 20 nm。 A. 是一个较大范围的共聚焦显微镜图片。 B-D 是 A 中一个细胞的放大