血液肿瘤流式免疫分型.ppt

流式细胞术在血液肿瘤免疫分型中的应用（Flow Cytometry,FCM) 中国医学科学院 血液学研究所 中国协和医科大学 血液病医院 王慧君 流式细胞仪(Flow Cytometer) 是集光电子物理，光电测量，计算机，细胞荧光化学，单抗技术为一体的高科技细胞分析仪。 FACSVantage FACSCalibur 流式细胞仪结构 ?激光光源及光束形成系统 ? 流动室及液流驱动系统 ? 光学系统：透镜、滤光片、小孔，聚焦光源， 收集不同波长的荧光信号。 ? 信号检测与分析：光电倍增管（PMT）、补偿 电路。荧光信号转换为电信号，并将信号放大。 ? 存储、显示、分析系统：计算机。 ? 细胞分选系统 液流系统 光学系统 电子系统 分选系统 工作原理 流式细胞术（Flow Cytometry, FCM） 流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）是一种可以快速、 准确、客观，同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性，并加以定量的技术，同时可以对特定群体加以分选 研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微球等 研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量 流式细胞术分析参数 细胞固有参数（散射光参数） Forward scatter(FSC) Side scatter(SSC)(SSC) 荧光参数 FL1-FITC FL2-PE FL3-PerCP PL4-APC 荧光素种类 FITC(异硫氰酸荧光素）：绿色 530nm PE（藻红蛋白）：橙黄色 575nm PerCP(多甲藻黄素叶绿素蛋白）：深红色 675nm PI(碘化丙啶）：橙红色 620nm 488nm波长的氩离子激光激发 APC(别藻兰蛋白）：红色 660nm 630nm波长的氦氖激光或红色二极管激光激发 数据显示方式 单参数直方图 双参数二维点图 等高图 二维密度图 三维图 横轴：细胞大小 纵轴：颗粒 CD45为白血病的共同抗原，巨核系、红系阴性 髓系表达CD56(黏附因子)预后差 R1：淋巴细胞 R2:原始细胞 R3:单核细胞 R4：粒细胞，嗜酸在上 R5：有核红细胞 流式细胞仪在血液学中的应用 白血病和淋巴瘤的免疫分型 淋巴细胞亚群分析 CD34+造血干/祖细胞的检测 细胞增殖周期测定和DNA倍体分析 凋亡检测 活化血小板及网织血小板的检测 阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH） 网织红细胞计数 白细胞分类计数 细胞因子的测量 细胞分选 标本来源 PB BM BM活检标本 淋巴组织穿刺液 浆膜液 脊髓液 皮肤 粘膜 其他组织穿刺标本 各种标本都可剪成小块，经研磨、过滤，制成单细胞悬液。 标本的储存 短时间储存：室温（16-28） 长时间储存：室温 16为宜 肝素：48-72小时 EDTA:12-24小时（髓细胞在此条件下会裂解） 柠檬酸钠：PB72小时，但高浓度的ACD会引起PH值变化导致BM细胞死亡。 免疫分型的原理 白血病细胞本身未发现特殊性的白血病抗原。免疫分型的原理是基于白血病细胞病变时分化阻滞学说。白血病细胞与正常髓系和淋巴祖细胞一样，会出现某个细胞发育阶段的抗原表达特征。由于细胞分化级系缺乏绝对的界限，所以免疫分型常采用一组级系相关的单抗来确定其相关抗原的存在。 三色免疫荧光标记中分析参数 FSC SSC FL1-FITC FL2-PE FL3-Percp AML抗体组合 CD19 / CD117 / CD45 CD7 / CD33 / CD45 CD34 / CD13 / CD45 HLA-DR/ CD10 / CD45 CD14 / CD15 / CD45 CD22 / CD20 / CD45 CD3 / CD56 / CD45 CD64 / CD11b / CD45 正常血细胞分化发育过程中免疫标志变化特点以及白血病细胞免疫标志特点 常用各系血细胞CD抗原 1、T系：CD1-CD8（CD6不用） 2、B系：CD10, CD19-CD24, FMC7 3、髓系：CD11b,CD13-CD16,CD33,CD64 4、干祖：CD34, CD117, CD38, HLA-DR CD22、CD19全B抗原 CD34、TdT:B前体细胞 慢淋、套淋巴瘤表达CD5 CD2、CD7全T抗原 CD14：幼单、成熟单表达，原单不表达 CD34、DR原始粒 CD33：粒、单共同表达，粒弱、单强 M2：CD19表达 CD10：普通B特异性标记 正常BM各系细胞比率 淋巴20-25%: