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Chapter 5 Modification of Enzyme Molecule 第五章 酶的分子修饰 Contents of chapter 5 什么是酶分子修饰？ 通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。即：在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团（物质），特别是具有生物相容性的物质，进行共价连接，从而改变酶的结构和性质。 第一节 为什么要进行酶修饰 限制酶大规模应用的原因： 1)细胞外稳定性差； 2)酶活性不够高； 3)具有抗原性。 1）提高酶的生物活性（酶活力） 蛋白一级结构通过内部氨基酸侧链基团的相互作用,按热力学最稳定方式形成了特有的高级结构.(即一级结构的氨基酸顺序决定了高级结构),而高级结构决定了功能. 一级结构修饰后发生改变很多情况下会引起高级结构发生改变,从而改变蛋白功能(包括酶活力) 热稳定性 修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶内部基团形成多点交联。使酶的天然构象产生“刚性”结构。 对抑制剂稳定性 大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间障碍或静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖”了酶的活性部位。 对水解酶的稳定性 A 大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶接近酶分子。“遮盖”酶分子上敏感键免遭破坏。 B 酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减少了受蛋白水解酶破坏的可能性。 4) 其它 大分子修饰剂本身是多聚电荷体，能在酶分子表面形成“缓冲外壳”，抵御外界环境的极性变化，维持酶活性部位微环境相对稳定 酶蛋白化学修饰的局限性 1.某种修饰剂对某一氨基酸侧链的化学修饰专一性是相对的，很少有对某一氨基酸侧链绝对专一的化学修饰剂。 2.酶的化学修饰只能在具有极性的氨基酸残基侧链上进行，目前还不能用化学修饰的方法研究非极性氨基酸残基在酶结构与功能关系中的作用。 3.酶化学修饰的结果对于研究酶结构与功能的关系能提供一些信息，如某一氨基酸残基被修饰后，酶活力完全丧失，说明该残基是酶活性所“必需”的，为什么是必需的，还得用X射线和其他方法来确定。因此化学修饰法研究酶结构与功能关系尚缺乏准确性和系统性。 第二节 酶分子修饰部位及专一性分类 酶蛋白结构部位分类 修饰专一性分类 1)非专一性化学修饰 用非专一性的修饰试剂与氨基酸侧链基团作用。 若某基团被修饰后： 酶活性不变——该基团可能不是酶的必需基团 酶活性降低或丧失——该基团可能是酶的必需基团 2)专一性化学修饰（基团专一性修饰） 用专一性化学修饰剂修饰酶活性中心的某一氨基酸残基的侧链基团。 3)亲和标记（位点专一性修饰） 采用的修饰试剂是根据底物的化学结构设计合成的含有活泼反应基团的底物类似物。 利用酶对底物的特殊亲和力将酶加以修饰标记。 第三节 酶分子的修饰方法 金属离子置换修饰 大分子结合修饰(共价/非共价;多结合水不溶分子) 侧链基团修饰(多结合水溶解性小分子) 肽链有限水解修饰 氨基酸置换修饰 酶分子的物理修饰 (1) 酶的金属离子置换修饰 把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方法称为金属离子置换修饰。 α-淀粉酶中的钙离子（Ca2+），谷氨酸脱氢酶中的锌离子(Zn2+)，过氧化氢酶分子中的铁离子(Fe2+)，酰基氨基酸酶分子中的锌离子（Zn2+）,超氧化物歧化酶分子中的铜、锌离子(Cu2+,Zn2+) 若从酶分子中除去其所含的金属离子，酶往往会丧失其催化活性。如果重新加入原有的金属离子，酶的催化活性可以恢复或者部分恢复。若用另一种金属离子进行置换，则可使酶呈现出不同的特性。有的可以使酶的活性降低甚至丧失，有的却可以使酶的活力提高或者增加酶的稳定性。 金属离子置换修饰的过程 a. 酶的分离纯化：首先将欲进行修饰的酶经过分离纯化，除去杂质，获得具有一定纯度的酶液。 b. 除去原有的金属离子：在经过纯化的酶液中加入一定量的金属螯合剂，如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使酶分子中的金属离子与EDTA等形成螯合物。通过透析、超滤、分子筛层析等方法，将EDTA-金属螯合物从酶液中除去。此时，酶往往成为无活性状态。 c. 加入置换离子：于去离子的酶液中加入一定量的另一种金属离子，酶蛋白与新加入的金属离子结合，除去多余的置换离子，就可以得到经过金属离子置换后的酶。 金属离子置换修饰只适用于那些在分子结构中本来含有金属离子的酶。 用于金属离子置换修饰的金属离子，一般都是二价金属离子。 (2) 酶的大分子修饰 使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护酶的一些添加物，如聚乙二醇、右旋糖苷等，它们既能通过氢键固定在酶分子表面，也能通过氢键有效地与外部水相连，从而保护酶的活力。 一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能