死活细胞的鉴定.PPT

死活细胞的鉴定 李伟 liweibio@126.com 死活细胞的鉴定方法有很多种，常用的有染色法和仪器分析法。染色法是常用的细胞死活鉴定方法，简便，易于操作。但是通过直接的形态观察来鉴别细胞死活，实验结果很容易受操作者的主观因素的影响，存在一定的误差，所以，在实际操作中也常采用一些仪器来进行精确的批量检测。 不同的死活细胞鉴定方法有各自不同具体的反应机理，但无论采用何种办法，都是利用了死活细胞在生理机能和性质上的差异。 实验原理 1.染色原理:根据死活细胞性质上的差异 细胞膜通透性的差异； 细胞在代谢上的差异  活细胞的细胞膜是一种选择透性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性的通过；而细胞死亡之后，细胞膜受损，通透性增加。常用的以台盼蓝鉴别细胞死活的方法就是利用了这一性质。台盼蓝，又称锥蓝，是一种阴离子型染料，不能透过完整的细胞膜。所以经台盼蓝染色后只能使死细胞着色，而活细胞不被着色。甲基蓝有类似的染色机理。 死活细胞细胞膜通透性的差异： 死活细胞在代谢上的差异： 死活细胞在代谢上的差异是采用美蓝染料鉴定酵母细胞死活的依据。美蓝是一种无毒染料，氧化型为蓝色，还原型为无色。由于活细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化性变为无色的还原型，因此美蓝染色后活的酵母细胞无色；而死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们的无还原能力或还原能力极弱，使美蓝处于氧化态，从而被染成蓝色或淡蓝色。 AO-EB染色法：The image below shows human lymphoma cells treated with the chemotherapy agent camptothecin. The cells that are undergoing apoptosis appear yellow and show the characteristic membrane blebbing (bubble formation)seen in cells dying via apoptosis. 用某种对植物无害的染料稀溶液对活细胞进行染色称活体染色。中性红是常用的活体染料之一。在中性或微碱性环境下，植物的活细胞能大量吸收中性红并向液泡排泄，液泡一般呈酸性，进入液泡的中性红解离出大量阳离子而呈樱桃红色, 原生质及壁不染色。死细胞的液泡已消失因而不产生液泡着色现象，中性红阳离子却与带一定负电荷的原生质及细胞核结合而使原生质及细胞核染色。 成长的细胞是一个渗透系统，活的原生质具有选择透性，原生质内部包含着一个大液泡，具有一定的溶质势。当细胞与外界低水势溶液接触时，细胞内的水分外渗，原生质随着液泡一起收缩而发生质壁分离；其后，当与清水（或高水势溶液）接触，细胞又因液泡的吸水膨胀而发生质壁分离复原。死细胞因其原生质的选择透性已遭破坏，故与低水势溶液接触时不产生质壁分离。 洋葱内表皮细胞的死活鉴定 洋葱内表皮细胞的死活鉴定 中性红是一种低毒性染料，为常用的活体染料之一，可以使活细胞液泡着红色，而细胞质和细胞核不被着色；死细胞的液泡不被着色或浅染，染料弥散于整个细胞中，细胞核和细胞质被染成红色。 中性红是一种弱碱性 pH 指示剂，变色范围 pH6.4～8.0 之间（由红变黄）。在中性或微碱性环境中，植物的活细胞能大量吸收中性红并向液泡中排泌，由于液泡在一般情况下呈酸性反应，因此，进入液泡的中性红便解离出大量阳离子而呈现樱桃红色，在这种情况下，原生质和细胞壁一般不着色；死细胞由于原生质变性凝固，细胞液不能维持在液泡内，因此，用中性红染色后，不产生液泡着色现象，相反，中性红的阳离子，却与带有一定负电荷的原生质及细胞核结合，而使原生质与细胞核染色。 实验方法及步骤  1、材料的处理：取洋葱鳞茎内表皮细胞或人的口腔粘膜上皮细胞，室温放置30min以上。 2、死活细胞的鉴定 （1）台盼蓝法 取洋葱鳞茎内表皮细胞（新鲜与放置后的材料），用0.4%的台盼蓝染液染1~2min，封片观察。注意比较放置材料和新鲜制备材料染色效果是否存在差异，二者在死活细胞比率上有无区别。 以人的口腔黏膜上皮细胞重复同样的操作。 （2）中性红法 取洋葱鳞茎内表皮细胞（新鲜与放置后的材料），用1/3000的中性红染液染5min，封片观察、比较。对两类材料染色后，于盖片的一侧滴加浓蔗糖溶液，在另一侧用吸水纸吸，5分钟后观察比较染色效果是否发生变化。 （3）美蓝法 取酵母细胞（新鲜与放置后的材料），用0.1%吕氏碱性美蓝染液染2min，封片观察、比较。 分析 1.台盼蓝法染色鉴定中，蓝色的为死细胞，不被染色的为活细胞。 2.中性红染色法鉴定中，活细胞只有液泡着色，而死细胞