总RNA的提取及RT-PCR课件.pptVIP

RT-PCR技术;一、真核生物基因的表达 真核生物的基因含有大量的非编码区，称为内含子（intron），真正编码蛋白的区段是被内含子隔开的，这些编码区叫做外显子（exon）。真核生物的DNA转录成为RNA之后，经过剪切和拼接，去掉这些非编码区，才形成成熟的mRNA，由mRNA再翻译成蛋白质。;基因;二、RT-PCR技术的应用 ;实验一 Trizol法提取细胞总RNA （一步法） ; ; RNA实验失败的主要原因是RNA酶的污染。由于RNA酶广泛存在而稳定，可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等，只要存在少量的RNA酶就会引起RNA的降解，而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果，所以建立一个无RNA酶的环境对于制备RNA很重要。;常用的RNA酶抑制剂： 焦磷酸二乙酯（DEPC）：与RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合，有高致癌性。（实验准备阶段使用） 异硫氰酸胍、氯仿：提取RNA同时也使RNA??失活。 RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。（合成cDNA阶段使用） ; 1.在实验室最好有专门的RNA操作区，离心机、移液器、试剂等专用。RNA操作区应保持清洁，并定期进行除菌。 2.相关耗材(Ep管、Tip头)应先用0.1% DEPC水浸泡过夜并高压消毒。也可直接使用厂家供应的无RN