变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE).ppt

从这一步开始，带上手套。 配置试剂时一定要用去离子水，可以配置不同梯度的变性溶液备用，注意变性溶液中大颗粒的过滤及脱气。 制胶洗膜时用的各个容器要用去离子水洗涤干净，以防止氯离子污染。 灌胶前准备好所有需要的东西，试剂、枪头，甚至物品摆放的位置。 制胶是实验的关键，在往玻璃板中灌胶时要匀速地转动滑轮，将凝胶液匀速地灌入玻璃板。 灌胶后立刻清洗注射器，以防丙烯酰胺凝固，堵塞管子。 DGGE制胶主体部件： 上样的胶孔要用去离子水冲洗干净并吸干。 PAGE胶装入电泳支架时注意用去离子水润滑橡胶垫。装入后在胶孔中加入缓冲液。 上样时上样器要深入胶孔底部。 尽量在同一个胶上比较所有样品，每一个胶上要有marker lane。 将胶放入电泳槽中时注意正负极。 建议低电压电泳一段时间，在样品完全进入胶中之后再升电压。 停止电泳后注意把电泳仪调零之后在关闭电源 剥胶需要细致，用好去离子水和保鲜膜。 染色前做好胶样品顺序的标记。 银染、EB染色和SYBRGreen染色。 ——垂直电泳 获得高质量的DGGE图谱。 DGGE条带的回收 －－注意紫外条件下操作的安全。 －－尽量减少DNA在紫外下的照射时间。 －－不同长度目标片段从切胶条带中的回收。 测序注意要点 －－回收条带的DNA在PCR扩增后，一定要克隆 －－确认克隆与母条带可以跑到同一个位置后，再送去测序 －－每个条带至少测3个克隆 DGGE图谱的聚类分析、相似性分析 用Quantity One（Bio-Rad，USA）软件对DGGE图谱进行数字化处理。按照如下公式计算多样性指数（Shannon-Wiener index） 其中，s代表每泳道中的条带数量；Pi为泳道中第i条带灰度（height of the peak）占该泳道总灰度的比例。 菌群均匀度（evenness，E）：E=H′/H′max，H′max=ln S 4. DGGE 的优缺点 优点 (1) DGGE的最大优点就是无需进行微生物培养，且能检测出难以或不能培养的微生物，同时检测多种微生物 （2）突变检出率高。DGGE的突变检出率为99%以上几乎可以检出所有突变 （3）可将突变分子完好无损地同野生型分子分开用于进一步的分析 （4） 无须标记 。DGGE不需同位素掺入，可避免同位素污染及对人体造成的伤害。 （5)操作简便、快速、重复性好、结果准确可靠。电泳前只需一步操作，DGGE一般在24小时内即可获得结果。 PCR-DGGE方法则能客观完整地鉴定微生物，根据参考菌株和样品16S rRNA的PCR产物在凝胶中的相对位置来进行判断．若割胶测序，然后序列比对，就可以得出遗传相关性 （6)可用于未经扩增的基因组 DNA ,可检测出象甲基化这样的 DNA 修饰 缺点 (1)只能分离较小的片段 ( 500 bp) ,对于大片段的分离效率下降 (2)DGGE图谱中单一的条带并不总是代表单一的菌株 ,或是在不同的泳道中移动到同一位置的条带可能由不同的细菌组成 (3)DGGE通常显示群落中优势种类的 r DNA片段,只有占整个群落细菌数量约 l%或以上的类群能够通过 DGGE检测到。 (4)由于某些种类的 16S r DNA不同拷贝之间的多态性问题 ,可能导致自然群落中细菌数量的过多估计。 (5)DGGE技术对微生物的分类鉴定依赖于基因数据库 ,若数据库中基因序列信息不够丰富 ,将会限制 DGGE的使用。 (6)需要专门设备，用计算机对序列进行分析， (7)需要进行预实验 昂贵的“ GC 夹板” 用含有毒性物质甲酰胺的梯度凝胶 (8)无法确定突变在 DNA 片段中位置 附： DGGE 操作步骤 1. 将海绵垫固定在制胶架上，把类似‘三明治’结构的制胶板系统垂直放在海绵上方，用 分布在制胶架两侧的偏心轮固定好制胶板系统，注意一定是短玻璃的一面正对着自己。 2. 共有三根聚乙烯细管，其中两根较长的为 15.5cm，短的那根长 9cm。将短的那根与 Y形管相连，两根长的则与小套管相连，并连在 30ml 的注射器上。 3. 在两个注射器上分别标记‘高浓度’与‘低浓度’ ，并安装上相关的配件，调整梯度传送系统的刻度到适当的位置! 4. 反时针方向旋转凸轮到起始位置。为设置理想的传送体积，旋松体积调整旋纽。将体积设置显示装置固定在注射器上并调整到目标体积设置，旋紧体积调整旋纽。例如16*16cm gels(1mm thick)：设体积调整装置到 14.5。 5. 配制两种变性浓度的丙烯酰胺溶液到两个离心管中。 6. 每管加入 18 μl TEMED，80 μl 10%APS，迅速盖上并旋紧帽后上下颠倒数次混匀。用连有聚乙烯管标有‘高浓度’的注射器