重组人干扰素生产工艺-1.pptVIP

4.1 干扰素α-2b分离工艺过程 菌体裂解 预处理 初级分离 (1)菌体裂解 裂解缓冲液：纯化水配制，2℃～10℃（pH7.5） 使用保护剂：EDTA，PMSF。 破碎－20℃菌体：2厘米以下的碎块 搅拌：加裂解缓冲液，2℃～10℃，2hr 冻融: 细胞完全破裂，释放干扰素。 (2)预处理-沉淀 加絮凝剂聚乙烯亚胺: 2℃～10℃，搅拌45min，对菌体碎片进行絮凝。 加凝聚剂醋酸钙溶液: 2℃～10℃,搅拌15min，对菌体碎片、DNA等进行沉淀。 (3)离心 连续流离心机：2℃～10℃，16000 r/min 收集上清液：含有重组干扰素蛋白质 杂质沉淀：121℃、30min 蒸汽灭菌,焚烧处理。 （4）初级分离 盐析: 4M硫酸铵，2℃～10℃，搅匀,静置过夜。 离心：连续流离心机，16000 r/min 保存：收集沉淀，粗干扰素，4℃保存。 4.2、干扰素纯化工艺过程 溶解粗干扰素 沉淀与疏水层析 阴离子交换层析与浓缩 阳离子交换层析与浓缩 凝胶过滤层析 无菌过滤分装 (1) 溶解粗干扰素 配制纯化缓冲液： 超纯水，pH7.5磷酸缓冲液，0.45 μm滤器和10 ku超滤系统，百级层流下收集。冷却至2℃～10℃。 检查: 缓冲液的pH值和电导值。 溶解： 2℃～10℃，匀浆，完全溶解。 (2) 沉淀与疏水层析 等电点沉淀（1）：磷酸调节至pH5.0，沉淀杂蛋白，离心收集上清液。 疏水层析：干扰素吸附在疏水层析柱中 除非疏水性蛋白 洗脱与收集：0.01M磷酸缓冲液（pH8.0）。 等电点沉淀（2）：磷酸调节pH4.5，调节电导值40 ms/cm，2℃～10℃，静置过夜 超滤：1000 ku超滤膜过滤，除去大蛋白。 透析除盐：调整溶液pH 8.0，电导值，10 ku超滤膜，0.005 M缓冲液。 (3)阴离子交换层析与浓缩 0.01M磷酸缓冲液（pH8.0）平衡树脂。 盐浓度线性梯度5～50 ms/cm进行洗脱， 配合SDS收集干扰素峰。 浓缩：调整溶液和电导，10 ku超滤膜，0.05M醋酸缓冲液（pH5.0）中透析。 （4)阳离子交换层析与浓缩 用0.1M醋酸缓冲液（pH 5.0）平衡树脂。 上样，相同缓冲液冲洗。 盐浓度线性梯度5～50 ms/cm进行洗脱 配合SDS收集干扰素峰。 浓缩：10 ku超滤膜进行。 (5)凝胶过滤层析 洗涤液：0.15 M NaCl的0.01M磷酸缓冲液（pH7.0）清洗系统和树脂 上样，相同缓冲液进行洗脱。 合并干扰素部分 (6)无菌过滤分装 0.22 μm滤膜过滤干扰素溶液 分装 －20℃以下的冰箱中保存。 (7)检测项目 干扰素鉴别试验 干扰素效价测定 蛋白质含量，纯度测定，分子量 宿主残余蛋白、残余DNA 干扰素结构鉴定：紫外光谱，肽谱，N端序列 其他：热原，内毒素，残留抗生素 第十五章 重组人干扰素生产工艺 2010.4.12 主要内容 干扰素概述 基因工程假单胞杆菌的构建与保藏 干扰素的发酵工艺过程 干扰素的分离纯化工艺过程 1 .干扰素概述 干扰素的种类 干扰素的理化性质 干扰素的生物学活性 干扰素的临床应用 干扰素的生产工艺路线 1.1 干扰素的种类 概念： （interferon，IFN） 干扰素是一种细胞因子，它是机体感染病毒时，宿主细胞通过抗病毒应答反应，而产生的一组结构类似、功能相近的低分子糖蛋白。英文名称为Interferon，简称IFN。 发现：干扰素是1957年英国科学家Isaccs等发现的。他们把灭活的流感病毒作用于小鸡细胞，结果发现这些细胞产生了一种可溶性物质，这种物质能抑制流感病毒，并且能干扰其它病毒的繁殖，因此，他们将这种物质称为“干扰素”。以后科学家们进一步发现，机体对入侵的异种核酸（包括病毒）都产生干扰素以进行防御。当机体细胞受到病毒感染时，机体细胞产生干扰素，干扰病毒复制，它是机体抗病毒感染的防御系统。?  天然干扰素分类 1. 根据来源、基因序列和氨基酸组成分类I 型干扰素： IFNα、IFNβ、IFN τ、IFN ω 来源：白细胞、成纤维细胞、病毒感染的组织细胞等 功能 ：抗病毒感染、抗肿瘤生长 免疫调节(较弱）其中IFN-α为多基因产物，有23种以上的亚型。 II 型干扰素：干扰素γ（IFN?) 来源：活化的T细胞和NK细胞产生 功能：免疫调节 提高单核巨噬细胞、树突状细胞的抗原提呈能力 增强Tc细胞和NK细胞的杀