显微镜技术.PDFVIP

显微镜技术 显微镜是用来观察、记录和研究经过制片技术处理后被检物体细微结构的最主要的光学 精密仪器。它广泛地应用于各学科的领域中。这对微观世界的探索及理论的研究起着极其重 要的作用。 显微镜的种类繁多，不仅因制造年代和不同国家的产品有不同类型，而且在结构造型及 功能等方面亦各异。一般的，根据照明光源的性质来分可分为“光学显微镜”和“非光学显微 镜” 。光学显微镜是利用人眼可见的可见光或紫外线作为光源的，它分为单式显微镜和复式 显微镜。其中单式显微镜制造简单，放大率及性能均不高，它是由一块或几块透镜组成，如： 放大镜、平台解剖镜；而复式显微镜则是由多组透镜组合而成，并可根据结构、原理和应用 范围的不同分多种类型，如：常规普通复式显微镜、专用或多用特种显微镜（荧光和倒置显 微镜）及大型多用途的万能显微镜。非光学显微镜不是利用人眼可见的可见光或紫外线作为 光源的，而是利用电子束作为光源并且是以“ 电磁透镜”作透镜的，因而也称电子显微镜。 一、光学显微镜 光学显微镜（light microscope ）简称显微镜或光镜，是利用光线照明使微小物体形成放 大影像的仪器。目前使用最广泛的是普通光学显微镜，此外还有相差显微镜、暗视野显微镜、 荧光显微镜和倒置显微镜等。 （一）普通光学显微镜 1、原理 普通光学显微镜的基本工作原理是利用物镜和目镜的多组凸透镜将物像逐级放大并反 射到视网膜上的过程。（如图1-1）。而显微镜性能和质量的高低可通过分辨率、数值孔径、 放大率及焦点深度、视场直径等指标来反映。 分辨率（resolving power ）即显微镜的分辨本领，是指显微镜或人眼在 25cm 和明视距 离（能看清物像的最佳标准距离）处所能清楚分辨被检物体最小间隔的能力。它主要由物镜 的分辨率所决定而与目镜无关。具体公式如下： R 0.61λ 0.61λ = = N·A n·Sinα／2 其中 λ为照明光源的波长，如白光 λ≈0.5μm 。n 为介质的折射率，如空气 n=1 ，玻璃=1.52 ， 香柏油=1.51 ，石蜡油=1.46 。α 为镜口角，它是指在工作距离处位于物镜光轴上标本中的一 个点所发出的光线到物镜的前透镜有效直径两端所形成的夹角（图 1-2）。可见通过降低波 长、增大介质折射率和加大孔径角及增加明暗反差是提高分辩率的有效手段。 数值孔径（numerical aperture , NA. ）也称镜口率，是直接决定显微镜分辨率的一个重要 参数，其公式为：N·A ＝n·Sinα/2 ，其中镜口率数字越大，表示分辨力越高。 放大率（minifying power ）即放大倍数，是光镜性能的另一重要参数。它主要有4× 、10×、 40×和 100×四种，其中4×和 10×为低倍镜，40×为高倍镜，100×为油镜。另外，镜头长度随 倍数的增加依次增长，而在不同放大倍数的物镜筒上还标有不同颜色的环，以用于区别。 低倍镜、高倍镜以空气为介质，而油镜需以香柏油或石蜡油为介质。这样就避免了由于 油镜镜孔小，而使进入物镜的光线产生折射，从而导致视野暗淡，物像不清现象的发生。一 台显微镜的总放大倍数等于目镜放大倍数与物镜放大倍数的乘积，如目镜 10×，物镜为40× ， 其放大倍数为 10×40＝400 倍。常用显微镜的最大放大倍数为 1600×。物镜和目镜的放大倍 数可用下列公式计算： 镜筒长度(110mm) 明视距离（250mm ） 物镜放大倍数= ; 目镜放大倍数= 物镜焦距 目镜焦距 焦点深度（focal depth ）即当显微镜对标本的某一点或平面准焦时，焦点平面上下影像 清晰的距离或范围。一般的焦点深度越大可看到被检物体的全层；反之，则只能看到被检物 体的一薄层。公式为： k·