实验二 红曲发酵.pptVIP

红曲发酵及红曲色素的提取 生命科学学院 实验目的 1、了解红曲菌液体菌种的制备方法, 为红曲发酵实验准备液体种子。 2、了解固体发酵的工艺过程 , 在实验室中小规模制备红曲。 3、熟悉从红曲中分离代谢产物的方法，以及掌握红曲色素色价的测定方法。 实验原理 1、红曲 红曲又称红曲米，其发明至今己有一千多年的历史，它是以稻米蒸熟后接种红曲菌(Monascus)发酵制成的，可直接作为天然色素来使用，安全性高。 红曲制造过程 实验原理 2、红曲的主要成分及作用 1）红曲色素：黄色素、橙色素和紫红色素 2）活性酶 3）洛伐他汀等 4）抑菌物质：桔霉素(Citrinin)等 实验原理 3）红曲霉菌 实验材料及培养条件 思考题 1．比较固态发酵与液体发酵的优缺点，并指出固体发酵的应用范围。 2．萃取后米粒中仍带有红色, 是否会对结果产生影响? * * 生物工艺学实验：实验二 置入红曲霉菌 优质的成熟稻米Premium Grown Rice 第一次杀菌 1st Sterilization 植入菌种 Inoculation 固态发酵 Solid State Fermentation 二次杀菌过程2nd Sterilization 干燥 Drying 研磨 Grinding 红曲菌是腐生真菌，生长的最适pH为3.5-5，能耐pH3.5，尤嗜乳酸。 生长温度为26-42℃，最适温度为32-35℃；能耐10%乙醇。 能合成生物素、泛酸、尼克酸硫胺素、核黄素等。还能产生色素、乙醇、琥珀酸及少量乳酸、醋酸等。红曲菌的液化型α-淀粉酶的活性弱，而糖化型β-淀粉酶的活性较强，故可用来生产红色麦芽糖。红曲菌的蛋白酶的活性较高。 1、菌种：红曲霉菌 2、培养基（液体） 蔗糖 3%，(NH4)2SO4 0.3%，K2HPO4 0.1%,KCL 0.05%,MgSO4 0.05%，FeSO4 0.001%，酵母浸粉 0.5%，PH自然 3、固体发酵培养基 大米培养基：加水浸泡20h，（100℃,灭菌5min） 实验过程 1、察氏液体种子培养 配制制液体培养基。500mL 三角瓶中装液体培养基 150mL, 包扎后 0.1MPa 灭菌 20 分钟；液体培养基灭菌冷却后 , 每瓶中接入 1/4 支红曲斜面菌苔 ( 注意无菌操作 )；接种后置30℃恒温摇床中 180 rpm 摇瓶培养 3天。 2、固体培养基制备及接种 1）浸米 :25 ℃以上浸米 5—8h, 大米吸收水分约在 28%～30% 。 2）蒸米: 将浸好的米用清水淋去米浆水, 沥干, 即可蒸米。上汽火力要强, 待全部圆气以后，蒸煮3～5min, 出饭率在 135%, 饭粒呈玉色, 粒粒疏松, 不结团块。蒸米不能熟透。 3、摊凉接种 4、固态发酵 32～33 ℃保温保湿培养。每天翻曲一次，观察到曲粒表面略有干皮、少数曲粒略有微红斑点等现象时即可“吃水”, 使曲粒吸收一定水分, 以利菌丝逐渐向内生长。 5、红曲色素提取： 1）取 200g 固体发酵之红曲, 在植物粉碎机中将其粉碎； 2）将红曲粉放于 500mL 三角瓶中, 加入提取液(丙酮 : 水 =80:20)300mL； 3）室温下浸提 1 天, 每隔 2 小时摇动一次, 过滤； 4）沉淀用同样提取液洗涤 2 次, 每次 100ml, 合并滤液； 5）在旋转蒸发仪中减压蒸去丙酮( 尚有水分 )； 6）用 l mol/L HCl 调残留液(约 l00mL)的pH至3.0, 加至分液漏斗中； 7）用 150mL 醋酸乙酯分次抽提； 红曲色价测定（每天测一次，绘制色价曲线） 1）称取红曲米样品 0.5g, 放入带有刻度的 lO mL 具塞试管中； 2）加入 80%的乙醇 8 mL, 摇匀,　60℃水浴保温萃取0.5h； 3）取出冷却, 用普通定性滤纸过滤入lO mL 量筒中, 用 80% 乙醇洗涤残渣 2 次, 合并滤液, 并用 80% 乙醇定容至10mL； 4）以 80% 乙醇作对照, 在 505nm 波长下, 用 lcm 比色皿测定样品的吸光度。 5）计算: 红曲色价(以lg样品计)=A505×lO×2 注意：发酵后期, 若红色素产生量多, 可稀释后测定。 参数测定 *