动物基因工程1.pptVIP

腺病毒是无包膜的线性双链DNA病毒，其基因组长约36kb，两端各有一个反向末端重复区（ITR），ITR内侧为病毒包装信号。基因组上分布着4个早期转录元（E1、E2、E3、E4）承担调节功能，以及一个晚期转录元负责结构蛋白的编码。早期基因E2产物是晚期基因表达的反式因子和复制必须因子，早期基因E1A、E1B产物还为E2等早期基因表达所必须。因此，E1区的缺失可造成病毒在复制阶段的流产。E3为复制非必须区，其缺失则可以大大地扩大插入容量。 一般将E1或E3基因缺失的腺病毒载体称为第一代腺病毒载体，此类型载体可引发机体产生较强的炎症反应和免疫反应，表达外源基因时间短。E2A或E4基因缺失的腺病毒载体被称为第二代腺病毒载体，产生的免疫反应较弱其载体容量和安全性方面亦改进许多。第三代腺病毒载体则缺失了全部的或大部分腺病毒基因，仅可保留ITR和包装信号序列。第三代腺病毒载体最大可插入35kb的基因，病毒蛋白表达引起的细胞免疫反应进一步减少，载体中引入核基质附着区基因可使得外源基因保持长期表达，并增加了载体的稳定性。这一载体系统需要一个腺病毒突变体作为辅助病毒。 腺病毒载体的特点是：基因组重排率低，外源基因与病毒DNA重组后，能稳定复制几个周期；基因组较易操作；安全性能好，不整合人染色体，不导致恶性肿瘤发生；宿主范围广，对受体细胞是否处于分裂期要求不严格；外源基因表达水平较高。 腺病毒载体的缺陷是：重组的外源基因不能持久表达，病毒蛋白对体液和T淋巴细胞具有免疫原性。 利用猴肿瘤病毒SV40载体克隆表达外源基因 病毒-细菌杂合质粒 猴肿瘤病毒 牛痘病毒表达系统 牛痘病毒 逆转录病毒基因组结构 逆转录病毒是一种整合型的单链RNA病毒 逆转录病毒 逆转录病毒的生命周期 逆转录病毒载体参与的外源基因表达程序 小鼠胚胎发育卵泡阶段的细胞能在培养基中体外增殖，当把它们重新输回胚胎胚泡后，仍保留着分化成其他细胞（包括生殖细胞）的能力，这些细胞称为多效性胚胎干细胞（ES）。 ES在体外培养时可承受转基因操作而不影响其分化多效性，外源基因通过同源重组方式特异性整合在ES基因组内的一个非必需位点上，构成工程化胚胎干细胞，工程化胚胎干细胞经筛选鉴定和体外扩增，再输回小鼠胚胎胚泡中，最终形成转基因动物。 4. 工程胚胎干细胞法 胚胎干细胞基因转化法 ES细胞中转基因定点整合的载体 PCR鉴定转基因ES细胞 P1：neor同源序列 P2：HB1左侧同源序列 将目的基因以DNA转染的方式导入能传代培养的动物体细胞内，获得的转基因体细胞株作为核供体，和核受体(一般是成熟卵母细胞)进行体外融合重构以形成克隆胚胎，再将克隆胚进行胚胎移植给代孕的母畜,达到大量生产遗传同质哺乳动物的一种生物技术。 5. 体细胞转基因克隆法 三. 利用动物转基因技术研究基因的表达与功能 利用转报告基因探测动物基因组的调控序列 利用同源基因灭活细胞内源基因 利用反义基因抑制细胞基因表达 1.利用转报告基因探测动物基因组的调控序列 以不含表达调控元件的报告基因作为转基因，可在转基因动物发育的不同阶段和不同组织器官中检测其表达情况，进而揭示报告基因整合位点上游的表达调控机制。 报告基因作为转基因在宿主细胞中的表达 转报告基因及其生物学效应分析 白色 蓝色 2.利用同源基因灭活细胞内源基因 同源重组一方面可序列特异性灭活细胞内源基因（即基因打靶），直接构建功能丧失型缺陷株，阐明内源基因的生物学效应；另一方面又可将外源基因置换细胞内源基因或染色体区域，形成功能获得型突变体，用于改良动物物种和人体基因治疗。 重组细胞株富集程序 双标记法 3.利用反义基因抑制细胞基因表达 体外合成靶基因mRNA的互补RNA链(即反义RNA)，然后注射到细胞中。反义RNA与靶基因转录出的mRNA互补形成双链结构，促使其降解。 根据靶基因序列，设计合成一小段单链DNA(反义DNA)，它与靶基因mRNA5’端的翻译起始区互补并抑制其翻译。 反义RNA在宿主细胞内合成，将靶基因的部分序列反向克隆构成反义子结构，作为转基因，反义子利用其转录产物的互补作用特异性阻断靶基因mRNA的翻译。图7-15 四.利用转基因动物或细胞生产生物大分子 动物细胞高效表达异源蛋白的基本原理 利用哺乳动物细胞大规模培养技术生产复杂的人体蛋白 利用动物乳腺组织生产蛋白药物 1 动物细胞高效表达异源蛋白的基本原理 细胞培养物经甲氨喋呤处理后，绝大多数细胞死亡，但在存活下来的抗性细胞中dhfr基因均得以扩增。将待表达的外源基因与dhfr基因拼接在一起，重组分子转化内源DHFR活性缺陷型的细胞系；转基因细胞置于不含核苷的特殊培养基上生长，使得只有接纳了dhf