第四章蛋白质工程PROTEINENGINEERING.pptVIP

* * 目前研究主要集中在改造现有的蛋白质领域。 * 体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具，也是我们在实验室中改造/优化基因常用的手段。蛋白质的结构决定其功能，二者之间的关系是蛋白质组研究的重点之一。对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构，对突变基因的表达产物进行研究有助于我们了解蛋白质结构和功能的关系，探讨蛋白质的结构/结构域。 M13载体法具体做法：将待诱变的基因克隆在M13噬菌体载体上，人工合成一段改变了碱基顺序的寡核苷酸片段作为引物，在体外合成互补链，再经体内扩增基因，其中有1/2是突变了的基因，经一定的筛选便可获得突变基因。 * 同源建模法预测蛋白质三级结构 同源建模比较复杂，Swiss-Model可提供自动化的同源模建分析任务 http://www.expasy.ch/swissmod/SM_TOPPAGE.html * 本文本框中输入蛋白质序列 输入个人邮箱及邮件名称 点击提交，即可。 7.4 蛋白质工程的研究方法 * 按改动部位的多寡分为三类 小改（特定残基的替换）：通过定位突变或化学修饰完成；目前最常用 中改（肽段或结构域的替换）：对来源于不同蛋白质的结构域进行组装拼接 大改（从头设计）：完全从头设计蛋白质（全新蛋白） * 现有蛋白质的改造 步骤如下： 1、分离纯化需要改造的目的蛋白； 2、对目的蛋白进行氨基酸序列分析、X射线晶体衍射分析、核磁共振分析等分析； 3、获取编码目的蛋白的基因序列； 4、设计改造方案； 5、对基因序列进行改造（定点突变（M13、PCR法）等） ； 6、将改造的基因片段连入合适的载体表达； 7、分离、纯化表达产物并对其进行功能检测。 * 第一个成功的GFP突变体 GFP的首个重大改变是钱永健在1995年完成。GFP的单点突变（S65T）显著提高了GFP的光谱性质，荧光强度和光稳定性也大大增强。突变后的GFP激发峰转移至488 nm，而发射峰仍保持在509 nm，这和常用的FITC滤光片匹配，提高了GFP的应用潜力。 Heim, R., Cubitt, A.B., Tsien R.Y.Improved green fluorescence.Nature. 1995 Feb 23; 373(6516): 663-4. * 改变蛋白质结构的核心技术是基因的人工，目前常用的方法有：M13载体法和PCR扩增法。 定点突变 M13载体法原理：利用人工合成带突变位点的寡聚核苷酸作为引物，利用M13噬菌体载体系统合成突变基因。 PCR扩增法原理：利用人工合成带突变位点的诱变引物，通过PCR扩增而获得定点突变的基因。 * 7.5 蛋白质工程的应用 （一）研究蛋白质结构与功能的关系 （二）改变蛋白质的特性 （三）生产蛋白质和多肽类活性物质 （四）设计合成全新蛋白质 * 要点 蛋白质工程的主要内容？定点突变的方法？原理？ 试着在网络上查到某一个蛋白质（如：溶菌酶、血红蛋白、血清白蛋白、拓扑异构酶、分子伴侣、DNA聚合酶等）的一级结构序列及三级结构，分析其结构组成，再到相关网站上提交其氨基酸序列进行高级结构的预测，看看会有什么样的收获。 * 张成岗，贺福初编著。生物信息学方法与实践。科学出版社。2002年。 王大成主编。蛋白质工程。化学工业出版社，2002。 Further Reading: * * * 北大张龙翔等在对胰蛋白酶结构与功能研究的基础上, 在国内最早提出蛋白质工程研究的设计与构想。 在后基因组时代，生物学的中心任务是揭示基因组及其所包含的全部基因的功能。 而研究蛋白质的结构和功能，并在此项研究基础上人工改造蛋白质的结构，并获得我们所需要的活性蛋白质，正是蛋白质工程的主要任务和目标。 在广泛利用自然界存在的各种蛋白质的过程中发现，这些蛋白质只是适应生物自身的需要，而对于它们的产业化开发往往并不合意，需要加以改造。1983年美国基因公司的Ulmer首先提出蛋白质工程这个名词，它是指按照特定的需要，对蛋白质进行分子设计和改造的工程。自此之后，蛋白质工程迅速发展，生物工程的重要组成部分。 * 蛋白质工程首先是以蛋白质的结构为基础，通过蛋白质一级结构、晶体结构和溶液构象的研究，积累成千上万蛋白质一级结构和高级结构的数据资料，然后按照蛋白质形成的规律，经周密的分子设计，改造蛋白质或构建新的蛋白质。并在此基础上阐明生命体的遗传、进化、发育、生长、衰老、死亡的基本生物学规律，以及与人类健康和疾病相关的生物学问题. 蛋白质工程是在重组DNA技术应用于蛋白质结构与功能研究之后发展起来的一门新兴学科。蛋白质工程是在基因工程取得的成就的基础上，通过对蛋白质已知结构和功能的了解，融合蛋白质结晶学、蛋白质动力学、计算机辅助设计和蛋白质化学