实验三微生物形态观察及格兰仕染色.doc

实验三 微生物形态的观察革兰氏染色法一、实验目的? 1．熟悉微生物菌落的形态特征。? 2．通过微生物菌落形态的观察来识别微生物。 ．学习并掌握霉菌的制片方法了解四类常见霉菌的基本形态特征。 革兰氏染色法原理二、实验原理 区分和识别各大类微生物通常不外乎包括菌落形态(群体形态)和细胞形态(个体形态)等两方面观察。细胞的形态构造是群体形态的基础，群体形态则是无数细胞形态的集中反映，故每一大类微生物都有一定的菌落特征，即它们在形态、大小、色泽、透明度、致密度和边缘等特征上都有所差异，一般根据这些差异就能识别大部分菌落。霉菌可产生分枝的菌丝体，分为基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝生长到一定阶段分化产生繁殖菌丝，由繁殖菌丝产生孢子。霉菌菌丝体（尤其是繁殖菌丝）及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多（约为?3～10μm），常是细菌菌体宽度的几倍至几十倍。菌落形态较大，质地较疏松，颜色各异。菌丝体经制片后可用低倍显微镜或高倍镜观察。革兰氏染色法是?1884年由丹麦病理学家?C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为?G+菌和?G-菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。酵母细胞具有脱氢酶活力可将美兰还原成无色的美白，因此染不上颜色，而死细胞则被染上兰色大肠杆菌、及酿酒酵母混合菌悬液；曲霉（Aspergillus?sp.）、青霉、根霉（Rhizopus?sp.）和毛霉（Mucor?sp.）培养2～5d的马铃薯琼脂平板培养物培养24的大肠杆菌（Escherichia?coli）无菌培养皿、水浴锅、接种环、超净台、酒精灯、75%酒精、工业酒精、酒精棉球、记号笔等载玻片、盖玻片、接种针、无菌牙签擦镜纸、显微镜等。 牛肉膏蛋白胨培养基、LB培养基、马铃薯培养基（PDA）等；结晶紫、95%酒精、蕃红、液体石蜡、乳酸石炭酸棉蓝染色液卢哥氏碘液。美兰（又称次甲基兰，Methylene blue）硫酸钙、硫酸钠、冰醋酸；醋酸钾（钠）葡萄糖、蛋白胨、醋酸钾（钠）、琼脂。1．选择具有代表性的单菌落，在培养皿反面划个小圈，同时编号，直接用低倍显微镜观察每个圈内的菌落边缘生长特点以及菌落的质地、颜色和表面结构。? 观察上述菌落的侧面，描述其隆起程度。? 清洗：将废弃的染菌平板经煮沸杀死微生物后再清洗、晾干、备用。 霉菌菌落特征的观察：观察曲霉，青霉，根霉和毛霉平板中的菌落，描述述其菌落特征。注意菌落形态的大小，菌丝的高矮，生长密度，孢子颜色和菌落表面等状况。并与细菌、放线菌、酵母菌菌落进行比较。? 制水浸片观察：于洁净的载片中央，滴加一小滴乳酸石炭酸溶液，然后用接种针从菌落边缘挑取少许菌丝体置于其中，使其摊开，轻轻盖上盖片（注意勿出现气泡），置于低倍镜、高倍镜下观察。? 1)?曲霉： 观察菌丝体有无横隔、足细胞，注意分生孢子梗、顶囊、小梗及分生孢子着生状况及形状。? 2)?青霉： 观察菌丝体的分枝状况，有无横隔。分生孢子梗及其分枝方式、梗基、小梗、分生孢子的形状以及分生孢子穗，帚状分枝的层次状况。? 3)?根霉： 观察菌丝是否有横隔、假根、匍匐枝、孢子囊梗、孢子梗及孢囊孢子。观察孢囊破裂后的囊托及囊轴。? 4)?毛霉： 观察菌丝是否有横隔、菌丝的分枝情况以及孢囊孢子。革兰氏染色 分别取谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌、口腔细菌进行革兰氏染色。? 1）制片 1)?涂菌：取干净载玻片一块，在载玻片上加一滴生理盐水（或灭菌双蒸水），按无菌操作法取菌涂片，注意取菌不要太多。? 2)?干燥：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干。? 3) 固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰?2-3次固定（以不烫手为宜） 2）染色? 1)?初染：滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）染色?1～2min，水洗。? 2)?媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约?1min，水洗。? 3)?脱色：用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加?95％的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。? 4)?复染：用番红液复染约?2min，水洗。? 3）镜检：干燥后，用油镜观察。菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌，被染成红色的为革兰氏阴性菌。 混菌及口腔细菌的革兰氏染色 按上述方法，在同一