SDS-PAGE实验步骤.docxVIP

试剂：1. 5x样品缓冲液（10ml）:0.6ml 1mol/L的Tris-HCl（Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，25℃） ?　　50ml 0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液与x ml 0.1mol/L 盐酸混匀后，加水稀释至100ml）(pH6.8),5ml 50%甘油，2ml 10%的SDS，0.5ml巯基乙醇，1ml 1%溴酚蓝，?? 0.9ml蒸馏水。可在4℃保存数周，或在－20℃保存数月。?? H2. 凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml。过滤后置棕色瓶中，?? 4℃保存，一般可放置1个月。33. pH8.9分离胶缓冲液： Tris 36.3g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH8.9，定容至100ml， 4℃保存。4. pH6.7浓缩胶缓冲液： Tris 5.98g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH6.7，定容至100ml， 4℃保存。5 v) L: Q, N7 y5.?? TEMED（四乙基乙二胺）原液。; _ Z0 Z1 g?? V( M# p* t/ O6. 10%过硫酸铵（用重蒸水新鲜配制）。+ q! c* B0 a+ p1 j+ k, I6 G?? h1 d7.?? pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，加蒸馏水约900ml，调pH8.3后，用蒸馏水定容至1000ml。?? 置4℃保存，临用前稀释10倍。8. 考马斯亮蓝G250染色液：称100mg考马斯亮蓝G250，溶于200ml蒸馏水中，慢慢加入7.5ml 70%的过氯酸，最后补足水到250ml，搅拌1小时，小孔滤纸过滤。: s! o# E e% W. hSDS凝胶的有效分离范围丙烯酰胺浓度（%）1512.5#107.55.0;线性分离范围15-435kDa15-60kDa18-75kDa30-120 kDa60-212 kDa5 器材) ~2 q S# |( o5 w　　电泳仪，电泳槽，水浴锅，摇床。; c$ }7 M$ U* s4 e?? a样品制备将蛋白质样品与5X样品缓冲液（20ul＋5ul）在一个Eppendorf管中混合。放入100℃加热5－10min，离心，取上清点样。* t( A) i; a ^( g电泳8 l# j s) S! j. b1. 将玻璃板、样品梳、Spacer用洗涤剂洗净，用ddH2O冲洗数次，再用乙醇擦拭，晾干；4 ^* P# j2 G: h: G% M }2 ^6 u2. 将两块洗净的玻璃板之间加入Spacer，装好玻璃板；3. 按如下体积配制10％分离胶8.0 ml，混匀；1 `; _5 w2 n: F?? C# c }/ ?　　ddH2O ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? 3.0 ml??? 1.0 mol/LTris-HCl pH=8.8 ?? 2.1 ml; K7 Q1 n4 |7 @6 R+ ~?? 30% Acr-Bis ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ??? 2.8 ml??? 10% SDS ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? 80 ul??? 10%AP ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? 56 ul4 q- ]. o9 s p5 A A: k4 N1 V F　　TEMED ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? 6 ul$ r, Q8 l( m/ l; j* }* A: ^$ ??? y4. 向玻璃板间灌制分离胶，立即覆一层重蒸水，大约20 min后胶即可聚合；) H1 U% |/ ~1 G; d5. 按如下体积配制6％浓缩胶3.0 ml，混匀； ddH2O ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? 2.0 ml??? 1.0 mol/LTris-HCl pH=6.8 ?? 400 ul Q1 n4 |7 @6 R+ ~?? 30% Acr-Bis ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ??? 600 ul??? 10% SDS ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? 36 ul??? 10%AP ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? 24 ul4 q- ]. o9 s p5 A A: k4 N1 V F　　TEMED ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? 4 ul$ r, Q8 l( m/ l; j* }* A: ^$ ??? y6. 将上层重蒸水倾去，滤纸吸干，灌制浓缩胶，插入样品梳；7. 装好