弗氏链霉菌Sfradiae S221角蛋白酶基因的异源表达及酶学性质研究.pdfVIP

摘要 摘要 S．221的角蛋白酶基因的克隆 本文主要研究了来源于弗氏链霉菌＆fradiae 和表达及蛋白酶纯化、酶学性质和酶底物切点的分析。l、角蛋白酶基因在大肠 杆菌和变铅青链霉菌＆lividans TK24中的表达。其中。去除链霉菌外分泌信号 肽(38aa)编码区的角蛋白酶原序列的基因命名为卿，其在大肠杆菌的表达中 以包含体的形式存在；而角蛋白酶成熟酶(191aa)带有一段N端前导肽(78aa) 以及链霉菌外分泌信号肽(38aa)的基因命名为枷，其在变铅青链霉菌＆lividans TK24中获得成功表达。2、sties基因获得成功表达后，该异源表达的角蛋白酶通 过硫酸铵沉淀、阴离子交换柱和分子筛技术获得纯化，纯化后的蛋白经聚丙烯 质浓度测定试剂盒测定，其浓度约为27．399／ml。3、在pH9．0的嘣s．HCI缓冲液 中，纯化后的角蛋白酶其最适反应温度为37(3，并能被丝氨酸蛋白酶抑制剂苯 甲基磺酰氟(PMSF)抑制，进一步证明本实验获得的角蛋白酶为丝氨酸蛋白酶家 族；另外，其降解天青角蛋白的活性在／JIA--硫苏糖醇(DDT)后有极大提高，DDT 能够使已发生聚集的晶体蛋白发生分子之间的二硫键解离，从而为角蛋白酶降 解天青角蛋白底物提供了方便。同时，在酶活性方面的研究中，酪蛋白、弹性 蛋白、绿色荧光蛋白(GFP)和天青角蛋白作为可被降解的底物。4、为了进一步 进行底物酶切位点的研究，绿色荧光蛋白和酪蛋白被角蛋白酶降解后，其降解 的肽段通过LC．MS QTOF技术分析。该角蛋白酶可能没有特异性的酶切位点， 而是把底物切成肽段， 该现象展示了此蛋白酶新的酶切方式，该种新酶切方式 的研究意义非常远大。 关键词：弗氏链霉菌角蛋白酶天青角蛋白绿色荧光蛋I兰I(GFP)肽段 Abstract Abstract Theaimofthis wastocloneand keratinase was study express gene(sties)which from S一22 sublimatethe keratinaseand S．fradiae1，then expressional analyzeenzyme andcutsitesofthe inE．coliands． activity substrates．I．Expressionof洳gene 1ividansTK24．Thekeratinase whichwasouteditsexo-secerated gene propeptide itwas asinclusioninE．coli．The peptide(38aa)wasnamed班and expressed body mature whichhasN-terminal its keratinase(191aa)geneleadingpeptide(78aa)and exo-secerated itwas ins． peptide(38aa)wasnamed洳and successfullyexpressed 1ividans TK24．2．The keratinasewas