生物物理2.ppt

五、蛋白质折叠/去折叠的实验研究方法 Fast/Ultra fast mixingStopped-flow, quench flow, continuous flow,.. T-jumpelectrical-discharge-induced T-jumpLaser-induced T-jump OthersLaser flash photolysisMechanic unfolding…… Stopped-flow 典型停流实验结果 Continuous-Flow 时间分辨CD Quench-flow H/D exchange T-jump Mixing Electrical-discharge-induced T-jump Laser-induced T-jump Rise 1-20?C in 500 ns-10 ?s Laser-induced T-jump Initiation of protein folding may be extended down to about 20 ps for a 10 kDa protein Laser flash photolysis Photodissociation takes less than 100 femtoseconds! Mechanic unfolding with AFM * Anfinsen实验 实验一： 1. 脲变性。RNAase + 8M脲 + 巯基乙醇 脲使得肽链展开，酶失活 2. 透析除脲和巯基乙醇， 3. pH~8弱碱性条件，溶液暴露于空气中， 重新氧化复性，酶活力重新获得 巯基乙醇 脲变性 过量巯基乙醇 导致还原 Anfinsen实验 实验二 1. 脲变性。RNAase + 8M脲 + 巯基乙醇 脲使得肽链展开，酶失活 2. 透析除巯基乙醇，然后通O2，再透析除脲 结果：酶活性恢复到~0.01 错配的二硫键只需要加一点点巯基乙醇就可复性 Anfinsen实验 1. 由实验一可知，模型２（生物合成的结果） 不成立，因为离体条件下复性的蛋白具有全部酶活性（后来又有实验证明体外解折叠是完全的，全人工合成） 2. 由实验二可知，模型１（空间障碍，只允许一种构象（二硫键配对））不成立，否则，复性的蛋白应该具有几乎全部酶活性 3. 模型３（先形成了热力学稳定构象，然后形成二硫键加固）能够解释 上述两个 结果。 结论：蛋白质一级结构决定三级结构 形成三级结构所需要的所有信息包含在一级结构中。 Anfinsen实验 Anfinsen实验的启示： 1. 成功需要一点点运气（简单的单结构域蛋白） 2. 抓住主要矛盾，善于洞察问题的本质 3. 严谨的推理不是得到正确结论的必要条件 正确的前提＋正确的推导＝正确的结论 正确的前提＋错误的推导＝正确或错误的结论 错误的前提＋正确的推导＝错误的结论（大概率） 错误的前提＋错误的推导＝正确或错误的结论 Model 1 and 2 都有实验支持 同时代取得的其它一些结果 折叠是以结构域为单位进行的。 ribonuclease A 去除 5 C-末端残基后, 蛋白质就丧失了正确形成二硫键的能力。 (H. Taniuchi, J. Biol. Chem. 245, 5459-5468; 1970) 含有两个或多个结构域的蛋白质，相邻结构域的解折叠是近似相互独立的。 Levinthal Paradox 对一个100个氨基酸残基的小蛋白质链 假设：只有主链二面角?和?可以转动 每个二面角只有3个可能值 则：总构象数为 3200 如果：每转动一次时间为10-15秒 则：历遍所有构象约需1072年 而：宇宙年龄为1.5?1010 三、 折叠的动力学考虑 有无中间体？ 最低自由能构象能否达到？ 折叠过程是怎样的？ 单一结构域的蛋白质，不存在平衡中间态。 两态折叠 折叠中间态的发现 首先在折叠、去折叠的早期动力学时(快速反应)中发现。(Cytochrome c: A. Ikai and C. Tanford, Nature 230, 100-102; 1971; ribonuclease A: T. Y. Tsong, R.L. Baldwin and E.L. Elson, PNAS 68, 2712-2715; 1971) 折叠中间态? 无辅基肌红蛋白(Apo-Mb)变性图（圆二色谱CD结果） 快速检测蛋白质折叠的方法 通过二硫键捕捉中间体－－捕获二硫键 碘乙酸抑制二硫键的生成，在不同的时间加入碘乙酸，得到二硫键数目不同，构象不同的蛋白质，然后利用柱层析分离 牛胰蛋白酶抑制剂的二硫键折叠途径 中间体 限速 蛋白质折叠过程