液相色谱教程(六)液相色谱定量分析原理.pptVIP

液相色谱教程(六)液相色谱定量分析原理 Waters 中国有限公司培训中心 液相色谱定量分析原理 在定性的基础上定量,需有纯物质作为标准物 液相色谱定量是相对定量的方法: 即由已知量的纯标样推算混合物中被测物的量 液相色谱法定量的依据是: 被测组分的量与响应值(峰高或峰面积)成正比 由已知量的标样可求得定量校正因子 定量校正因子:是定量计算公式中的比例常数,其物理意义是单位响应值(峰面积)所代表的被测组分的量 测定未知组分的响应值,通过定量校正因子即可求得其含量 液相色谱定量分析的步骤 开发一个适合定量分析的色谱方法: 确认被检测组分峰,并达到分离度(R)大于1.5 确定被测组分色谱峰的一致性(纯度) 确定方法的检测限及定量限;灵敏度及线性范围 用不同浓度的标准样品建立校正曲线 考查定量方法的准确度及精密度 用相应的色谱管理软件实施样品采集,数据处理及报告结果 鉴别需定量的色谱峰(定性) 定性鉴别每个要定量的色谱峰 首先用标样确定欲定量之色谱峰的保留时间(Rt) 通过比较保留时间,找到未知样中各色谱峰所对应的组份 色谱定性是用与标样比较保留时间的方法,判据并不充分 因此要明确： 保留时间相同，可能是同样的组份 保留时间不同，肯定不是同样的组份 用保留时间定性 用“标样”的保留时间(Rt)确认被测组份 进一步的确认(定性) 标准加入法 同时用其它方法 其它色谱方法(改变机理,如:用不同的色谱柱) 其它检测器 PDA, 光谱图比较、谱库检索 MS，质谱图解析、谱库检索 其它仪器方法 标准加入法举例 废水样品中五氯苯（PCP）的分析 确认定量峰的一致性 确认色谱峰的一致性(纯度) 保证每个色谱峰下只有一个被测的组份 检查是否有共流出的物质（杂质）干扰 色谱峰一致性(纯度)确认的方法 用光电二极管矩阵(PDA)检测器比较光谱图 峰纯度鉴定,2487双波长RatioPlot图形分析 2996的纯度角理论 HPLC定量分析常用术语(1) 样品(Sample):含有待测物,供色谱分析的溶液 样品类型(Sample Type)分为标样和未知两种: 标样(Standard) : 浓度已知的纯品 未知样(Unknow):浓度待测的混合物 样品重量(Sample Weight):待测样品的原始称样量 稀释度(Dilution):未知样品的稀释倍数 组分(Componance):欲做定量分析的色谱峰,即含 量未知的被测物 组分的量(Amount):被测物质的含量(或浓度) HPLC定量分析常用术语(2) 积分(Integrity): 由计算机对色谱峰进行峰面积测量的计算过程 定量限: 可以准确定量的样品最低量 一般要求色谱峰的信噪比(S/N)＞10:1 校正曲线(Calibration Curve): 组分含量对响应值的线性曲线,由已知量的标准物建立,用于测定待测物的未知含量 常用的定量方法 标准曲线法,分为外标法和内标法: 外标法 在液相色谱中用得最多 内标法 准确，但是麻烦 在标准方法中用得最多 外标法定量(一) 配制一系列已知浓度的标样 外标法定量(二) 采集不同浓度 标样的色谱图 积分,按外标法 定量计算,建立 标准曲线 外标法定量（三） 计算公式 特点 无需各组份都被检出、洗脱 需要标样 标样及样品测定的条件要一致 进样体积要准确 内标法定量(一) 配制一系列浓度的标样，其中加有内标样 内标法定量(二) 采集不同浓度 标样的色谱图 积分,按内标法 定量计算,建立 标准曲线 内标法定量(三) 计算公式： 特点： 无需各组份都被检出、洗脱 需要标样，需要内标样 结果与进样体积无关 内标法定量（四） 对内标物的要求 化学结构与待测组分相似(同系物、异构体) 在样品中不存在 不与样品中组份发生任何化学反应 保留值与待测组分接近 浓度（响应值）与待测组分相当 其色谱峰与其它色谱峰分离好 定量分析的数据处理方法 手工计算 用积分操作计算峰面积(响应值) 用已知含量对应峰面积计算响应因子 用未知物的峰面积通过响应因子计算含量 Waters软件程序计算 Empower 包含外标和内标法计算的程序 处理结果自动存贮至Project的Result中 其它软件计算 例如 EXcell 液相色谱定量的精密度 测量的精密度 精密度的衡量 测量精密度的计算 液相色谱定量的准确度 误差∶ E = O - T O∶观测到的值 T∶真值 准确度的衡量 色谱方法是相对定量方法,如不考虑损失及杂质干 扰等因素,其结果同“标样”的准确程度密切相关 一般的衡量方法是做回收率实验或不同方法之间的 比较：相关系数 相关系数： 其中，X及Y分别代表不同方法