铝离子对神经细胞突触生长影响.docVIP

铝离子对神经细胞突触生长影响 　　摘要：为了探讨金属铝离子在小鼠神经细胞生长分化中的影响，采用小鼠大脑皮层细胞作为实验材料，在细胞生长分化过程中加入浓度不同的金属离子，等细胞生长至14 d时，对细胞进行免疫荧光染色，使用激光共聚焦显微镜对细胞进行拍照，并利用ImageJ软件和GraphPad Prism 5.01软件对神经细胞突触的数目和大小进行统计学分析。结果表明：在铝离子浓度较低的情况下，不会对神经细胞的突触数目和突触大小造成影响；随着铝离子浓度的升高，作用时间越长，对神经细胞损伤越大，直至神经细胞全部死亡；而其影响主要表现在使突触数量减少，而对突触的大小并没有显著的影响 关键词：小鼠大脑神经细胞；神经细胞分化；铝离子；突触形成 中图分类号：Q253 文献标识码：A文章编号2017）8022903 1引言 自闭症谱系障碍（ASD）和阿尔兹海默症（AD）均是由突触功能障碍或突触病变引起的神经系统疾病[1]。突触形成和突触功能的完善受到特定基因的调控，突触功能障碍和突出病变与这些基因紧密相关。但是，基因外其他因素的影响同样不容忽视。体内金属离子含量失衡就是其中一个很重要的因素[2，3]。过去，很多研究用以证明人体内的各种金属离子的重要性和毒性，这些研究发现，金属离子对人体是否有害是有一个安全值的。当低于此安全值，有的金属对人体是无害的，甚至是不可缺少的；当超过这个安全值，即便是人体必须的金属元素，都会对人体造成伤害[4] 随着现在人们使用金属制品的增多，人们对金属离子特别是有毒金属离子的摄入量也随之增加，其在人体内长期蓄积，对机体神经系统的发育和功能产生干扰，当其浓度超过了安全值，便会对神经细胞造成伤害。在对自闭症和阿尔兹海默症患者的头发样品鉴定中发现，Zn、Ca、Fe、Mg、Mn和Se明显低于正常人；同时，Al、As、Cd、Hg和Pb的浓度偏高[5，6]。而且，症状的严重程度与体内有毒金属含量有很大关系[7] 为了探究铝离子对神经细胞生长分化特别是突触形成的具体影响及其作用机制，利用体外培养的小鼠大脑皮层神经元细胞，在不同的时间向细胞培养基中加入梯度浓度的AlCl3溶液，然后利用免疫荧光染色，对神经细胞突触的数量和大小进行记录并对实验数据进行统计学分析。试验结果表明：在金属浓度比较低时，无论作用时间长短，对神经细胞突触形成均没有影响；当Al离子浓度高于200 μM后，离子浓度越高，作用时间越长，对神经突触的伤害越大，直至神经细胞全部死亡，而且金属离子对神经细胞的影响主要表现在对突触数目的影响，而对突触的大小并没有显著影响 2材料与方法 2.1材料 小鼠大脑皮层神经元细胞。胎牛血清（FBS，生化试剂，Gibco公司）；B-27；运铁蛋白（Transferrin）；胰蛋白酶（Gibco公司）；葡萄糖（Glucose）；HEPES；盐酸阿糖胞嘧啶（Ara-C）；多聚-L-赖氨酸；AlCl3 2.2试剂与仪器 相差显微镜（奥林巴斯CKX41）；超净工作台（苏州净化）；二氧化碳培养箱（Thermo Fisher）；共聚焦显微镜（Nikon） 2.3方法 2.3.1实验溶液配制 利用胎牛血清、DMEM等试剂配置实验所需的细胞培养基及相关缓冲液。所有溶液均需调整渗透压和pH值至适宜细胞生长的实验进行的值，并以适当方式进行除菌[8] 2.3.2小鼠大脑皮层细胞培养 新生野生型小鼠，分离其大脑皮层与海马细胞，用0.25% Trypsin-EDTA消化酶消化12 min，消化完成后用培养基终止消化，然后将大脑皮层细胞与海马细胞吹打下来，加入镀有多聚赖氨酸的玻片上进行培养，分别在培养第1、4、9 d进行换液，同时向培养基中加入不同浓度的金属离子溶液。第1 d为神经元换无Ara-C的生长培养基，第4、9 d换含4 μM Ara-C 生长培养基[8]。培养14d后进行免疫荧光染色 2.3.3细胞免疫荧光染色 用4%多聚甲醛（PFA）在4 ℃环境中固定12 min；用1x的PBS清洗1次之后，用0.2% TritonX-100对神经细胞室温通透5 min，然后用1x的PBS浸洗5 min；用5%牛血清白蛋白（BSA）室温封闭30 min；吸去BSA后，一抗室温孵育2 h；然后用1x的PBS浸洗3次，每次5 min；加入荧光二抗，室温孵育30 min，在加入荧光二抗之后，所有的操作应注意避光；30 min后，用1x的PBS浸洗5次，每次5 min，最后用含抗荧光淬灭剂的封片液封片。封片完成后，在荧光显微镜下观察并采集图像 2.3.4数据处理 将所得图片使用软件Image J （National Institutes of Hea