第二章 发酵工业菌种改良3.ppt

一、蛋白质工程育种 酶或者蛋白质在医药、工业和环境保护中起着重要的作用，为了获得具有新功能的酶或者蛋白质，可以通过寻找新的物种，再从中分离筛选新蛋白，或者通过对天然功能蛋白进行改造的方法实现。 目前，根据实验的指导思想，可以把蛋白质工程方法分为理性设计（定点突变、定向改造）和非理性的体外定向进化（随机化突变、定向筛选）两大类。 1 定点突变技术 基于蛋白质工程的理论，以蛋白质结构和功能的计算机预测为基础，设计新的蛋白质氨基酸序列，应用重组DNA技术设计并构建具有新性质的蛋白质或酶的过程。 适用于三维结构已被解析的蛋白质。 普遍用于菌种改良。 2 融合蛋白和融合酶技术 利用蛋白质的结构允许某个结构的插入与融合，运用DNA重组技术使不同基因或基因片段融合，经合适的表达系统表达后即可获得由不同功能蛋白拼接在一起而形成的新型多功能蛋白。 应用于多功能工程酶的构建和研究。 定向进化技术 可以在尚不知道蛋白质空间结构或者根据现有的蛋白质结构知识尚不能进行有效的定点突变时，借鉴实验室手段在体外模拟自然进化的过程（随即突变、重组和选择），使基因发生大量变异并定向选择出所需性质或功能的蛋白质。 定向进化的原理 定向进化＝随机突变＋选择 定向进化与自然进化的异同点 定向进化的实质是达尔文进化论在分子水平上的延伸和应用。 定向进化是在体外模拟突变、重组和选择的自然进化，使进化朝着人们需要的方向发展。 进化动力不同： 保守突变 非保守取代； 进化方向不同 适应 突变的积累； 进化速度不同： 非常漫长 只需几年、甚至几天； 进化目标不同： 适应环境 超越生物学意义的要 求，探索所希望的蛋白质在顺序空间的可及性。 随机突变的策略 易错PCR技术(error-prone PCR) DNA改组(DNA shuflling)：由美国Stemmer 于1994 年首次提出 一项体外重组技术 易错PCR 易错 PCR（error prone PCR）是通过改变PCR的反应条件，增加DNA聚合酶在扩增时碱基错配的概率。 相对简单、快速、廉价的随机突变方法 增加错配几率的条件 降低一种dNTP的量，以dITP来代替，使碱基在一定程度上随机错配 使用错配概率较高的DNA聚合酶(Taq) 增加镁离子浓度，稳定非互补的碱基配对 加入锰离子，降低聚合酶对模板的特异性 DNA随机重组 将一组紧密相关的核酸序列随机片段化，这些片段通过自配对PCR或重组装PCR延伸，最后组装成一个完整的全长核酸序列。 主要步骤 目的DNA片段的获得 随机片段化 用DNase I处理 重组装PCR或者无引物PCR 筛选或选择 加入引物进行常规PCR 二 代谢工程育种 改变代谢途径 改变分支代谢途径的流向，阻断其他代谢产物的合成 扩展代谢途径 引入外源基因使原来的代谢途径向后延伸，产生新的末端产物；或者向前延伸，利用新的原料 转移或构建新的代谢途径 将催化一系列生化反应的多个酶基因克隆到不能产生某种代谢产物的微生物中，使其获得产生新的化合物的能力；克隆少数基因，使原来的代谢途径连起来，产生新的代谢产物；将催化某一代谢途径的基因组克隆到另一微生物中，使之发生代谢转移，产生目的产物。 第五节 菌种保藏 菌种退化 生产菌种或选育过程中筛选出来的较优良菌株，由于进行接种或保藏之后，群体中某些生理特征和形态逐渐减退或者完全丧失的现象。 1 常见的退化现象 目的代谢物合成能力降低，产量下降 发酵力和糖化力降低 孢子数量减少或增加 部分菌落变小或更大 生长能力更弱 生长速度变慢 菌种退化的本质：基因突变引起的生产能力下降 连续传代是加速发生退化的直接原因。 2 菌种保藏的原理 根据微生物的生理、生化特点，人工地创造条件，使微生物的代谢处于不活泼、生长繁殖受到抑制的休眠状态。 首先选取优良纯种，最好是休眠体 其次要创造最有利于休眠的环境条件(低温、干燥、缺氧、缺营养) 3 保藏方法 斜面保藏法（低温） 将菌种接种在不同成分的斜面培养基上，待菌种生长完全后，便置于4度左右的冰箱中保藏，每隔一段时间进行移植培养，再将新斜面继续保藏。 适用范围是各类微生物 3-6月 特点：操作简单，不需要特殊设备 矿油封藏法 原理：低温、缺氧、缺营养 方法：取细沙过40-60目筛，用10%盐酸处理2h，水洗至中性，烘干。取肥沃园土过筛，将细土与沙按1：2（质量比）混合，分装入安醅管内约2厘米高，加棉塞，间歇灭菌（三次）。灭菌后的的沙土，放在培养基上培养，经检查确认无菌后备用。 将菌苔已长好的斜面，注入无菌水3-5ml，用接种针轻轻将菌苔刮下，使其形成菌悬液。用无菌滴管吸取菌液滴入沙土管中，滴入菌液量以管中沙土全部湿润为度，沙土和菌液在管中高度约2cm，把装了菌液的沙土管放在装有干燥剂的真空干燥器，