综合实验设计 水稻转化.ppt

生物学综合实验技术 水稻愈伤组织诱导及转 GUS基因的鉴定 图4：农杆菌介导水稻遗传转化 A.水稻愈伤与农杆菌共培养 B.选择 C.分化 D.生根 E.炼苗和移栽 gus基因简介 gus基因是目前常用的一种报告基因，是β－D－ 葡萄糖苷酸酶(gus)基因，其表达产物β-葡萄糖苷酸酶 (GUS)能催化裂解一系列的β－葡萄糖苷酸 ，它可以将5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯（X－Gluc）分解为蓝色的物质,也可以将4-甲基-伞形花酮-β-D-葡萄糖苷酯(4-MUG)分解为蓝色物质。 其检测方法简单、快速、灵敏、稳定，且背景活性低。 gus基因的最大优点是它能测定外源基因表达的具体细胞和组织部位，这是其它报告基因所不能及的。 三、实验方案与步骤 Ⅰ 水稻愈伤组织诱导 Ⅱ 农杆菌感受态细胞的制备与转化 Ⅲ 水稻的农杆菌介导遗传转化 Ⅳ 水稻抗性愈伤组织的筛选与分化 Ⅴ GUS基因的染色 Ⅰ 水稻愈伤组织诱导 1. 水稻种子消毒： 在超净工作台上，取大概40粒去壳、胚完整的水稻种子放入50 mL无菌三角瓶中，用无菌水洗一遍之后倒掉无菌水，再倒入75%酒精之后，摇瓶30-60 s，用无菌水再洗一遍后倒掉无菌水，倒入2% NaClO，不时搅拌，30 min。然后用无菌水洗3次，每次摇瓶1 min，倒掉无菌水，将种子放入带无菌滤纸的培养皿中，分开排布，吸干。 2. 水稻种子接种与观察 将吸干的种子接入YN培养基，注意使胚朝上。每瓶接10粒，每小组5瓶。写上日期、接种人、放入培养室25℃暗培养。1周后调查计算污染率，2周后调查计算愈伤组织诱导率。 污染率=污染种子数/总种子数×100% 愈伤组织诱导率= 出愈伤种子数/总种子数×100% 3. 水稻愈伤组织的继代培养 在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑取自然分裂的胚性愈伤组织（淡黄色，致密呈球状），置入YYN培养基中，在28℃光照培养箱，继代培养1周。（如不马上用于转化，需转移至暗处，于25℃继续培养1周） Ⅱ 农杆菌感受态细胞的制备与转化 挑取根癌农杆菌LBA4404单菌落于3 mL的YEB液体培养基（含Rif 50 mg·L-1）中，28℃振荡培养过夜； 取过夜培养菌液1 mL接种于50 mLYEB（Rif 50 mg·L-1）液体培养基中，28℃振荡培养至OD600为0.5； 取2 mL菌液，13000 rpm，离心30 s, 弃上清； 加入1000 μL 20 mM CaCl2，使农杆菌细胞充分悬浮，冰浴30 min； 13000 rpm，离心30 s，弃上清，置于冰上，加入500 μL预冷的20 mM CaCl2，充分悬浮细胞，冰浴中保存，24 h内使用，或液氮中速冻1 min，置-70℃保存备用。 在200 μL感受态细胞中加入2-6 μL pCAMBIA1301质粒DNA，冰浴5 min，液氮中速冻5 min； 迅速转入37℃水浴中，热激5 min； 加入1 mL YEB液体培养基，28℃慢速振荡培养2－4 h； 3000 rpm离心4 min，去一部分上清，留取200 μL菌液涂布于含有50 μg·mL-1 Kan和50 μg·mL-1 Rif的YEB平板； 放置约0.5 h，待水份干后，28℃培养约24 h至长出菌落。 Ⅲ 水稻的农杆菌介导遗传转化 在侵染前三天挑取含有GUS基因的农杆菌接种到3 mL LB液体培养基中（25 mg·L-1链霉素和50 mg·L-1卡那霉素），28℃、200 rpm 培养至对数晚期(18-24 h)。 利用分光光度计测量菌液OD600值大约在0.6左右 将1中获得的菌液按1：100接种到50 mL新鲜的NGN液体培养基中（25 mg·L-1链霉素和50 mg·L-1卡那霉素），28℃、200 rpm 培养至OD值为0.5左右（大约5-6 h）。 把50 mL菌液转入2个50 mL离心管中，4℃、4 000 g 10 min，弃上清，加等体积的NGNM+AS培养基重悬菌体。 准备NGN溶液：向50 mL离心管中加入40 mL NGN,注意：取800 μL溶液滴加在GN培养基滤纸上（培养基上铺一层干净滤纸）。 将水稻愈伤组织浸入准备好的农杆菌中，侵染20 min，期间要缓慢摇动。 将浸染后的菌液倒出废液缸，用灭菌过的针管或枪头把残余的菌液吸净，再用滤纸把愈伤组织吸干，置于准备好的GN培养基上。22℃黑暗培养2 d。 Ⅳ 水稻抗性愈伤组织的筛选与分化 将共培养的水稻愈伤组织用无菌水洗涤6次，用无菌水+羧卞（500 mg·L-1）洗涤2次（洗涤时要不停的摇晃50 mL离心管，每洗涤一次用针管把无菌水吸出），用无菌纸吸干后置于工作台吹30 min。 将水稻愈伤组织置于N6D2S固体筛