13核酸的非放射性标记和高灵敏度检测 - 北京美莱博医学科技有限公司.docVIP

Hyb高效杂交液在开始操作之前，请认真阅读整个操作方法。Hyb高效杂交液在室温低于℃时，可能会产生沉淀。如果产生沉淀，可在℃加热、搅动使沉淀完全溶解。℃保存。 核酸杂交是一种应用于基因结构和表达分析、基因组研究和临床诊断的常规技术。技术的成功依赖于影响探针与靶序列结合的一系列因素，包括：杂交温度、探针浓度、离子强度、pH及杂交液的粘度等。 Hyb高效杂交液是经优化的适合在正电荷尼龙膜上进行Northern和Southern杂交分析的杂交液，典型的膜杂交需要长时间的孵育并且实验条件难于优化。而Hyb高效杂交液的独特配方和操作规程可有效地消除这些困难。Hyb高效杂交液仅需要杂交小时，而常规杂交则需要1224 小时。它也能明显地降低非放射性检测的背景。以使Northern膜上的低拷贝RNA和Southern膜上的单拷贝基因得以检出。 Hyb高效杂交液也适于各类cDNA表达芯片等。Hyb高效杂交液可用于探针的放射性和非放射性标记，并且在杂交后运用放射性和化学发光检测系统（如地高标记的探针）可得到相当的结果。 下图简要说明了放射性和非放射性标记的探针的杂交过程。 放射性标记的探针 非放射性标记的探针 一、cDNA 探针杂交【概论】 Hyb高效杂交液可用于Southern、Northern或菌落杂交。唯一不同的是杂交温度的差异。Northern和菌落杂交为℃。Southern杂交为℃。 本方法中所采用的杂交温度，适用于平均G/C含量(40%)的DNA探针的杂交。 对于G/C含量不同的探针的最适杂交温度，则必须通过试验才能确定，具体计算公式请参照附录。 建议Southern/Northern杂交时使用的cDNA探针浓度为2～10 ng/ml或1～2×106cpm/ml。（探针浓度大于10 ng/ml时虽可缩短杂交所需时间，但可能会加深背景）。菌落杂交时的探针浓度为100ng/ml。 高浓度探针不能直接加到膜上，因为局部探针浓度不均一会导致产生异常杂交信号。 【放射性标记的cDNA探针杂交】 在℃加热Hyb杂交液，充分搅动以彻底溶解沉淀。 在10×10 cm的膜上至少加入5ml杂交液，确保整块膜都能被杂交液覆盖，排除所有气泡，在℃连续振荡30分钟，进行预杂交。 将放射性标记的cDNA探针置于℃水浴中煮5分钟使之变性，然后迅速放在冰浴中冷却。 将放射性标记的探针加入到5 ml新鲜杂交液中，充分混匀。 去除预杂交溶液，加入预热的含放射性探针的杂交液，排除气泡，确保杂交液均匀地分布在整个膜上。 在℃连续振荡杂交2-6小时或更长时间（可以杂交过夜），视探针浓度而定。 在室温下用洗涤液I振荡洗膜2(15分钟。 在℃、洗涤液II中振荡洗涤30分钟，期间更换洗涤液一次。 用镊子将膜取出，滴去膜上多余的洗涤液。注意：不能让膜干燥，那怕部分变干也不行，否则以后很难脱除膜上的探针。 立即用塑料薄膜（保鲜膜）将膜覆盖，用胶纸固定在3 mm滤纸上，再用塑料薄膜包裹。 在℃，用2块增感屏进行X光胶片曝光。 【非放射性标记的cDNA探针杂交】 在℃加热Hyb杂交液，充分搅动使沉淀完全溶解。 在10×10 cm膜中至少加入5ml杂交液，使膜完全被杂交液覆盖，排除气泡，在℃连续振荡60分钟，进行预杂交。 将非放射性标记的探针在℃水浴中煮5分钟使之变性，然后迅速放入冰浴中冷却。 将变性的探针加入到5 ml新鲜杂交液中，充分混匀。 除去预杂交溶液，加入预热的含标记探针的杂交液，排除气泡，确保整块膜都被杂交液均匀浸润。 在℃连续振荡杂交2-6小时或更长时间（可以杂交过夜）。 在室温下，用洗涤液III将杂交好的膜振荡洗涤2次，每次30分钟，并更换洗涤液。每100cm2膜至少用20 ml洗涤溶液洗涤。 在℃，用洗涤液II将膜振荡洗涤2次，每次30分钟，并更换洗涤液。注意：对于与靶基因不是完全同源的探针来说，这一步的洗涤温度需降低至℃进行洗涤。 用镊子将膜取出，滴去多余的洗涤液。 膜直接进行酶联免疫显色或化学发光检测。注意：操作期间不能让膜干燥，否则很难脱除探针。二、寡聚核苷酸探针杂交建议杂交时使用的寡聚核苷酸探针的浓度为20～50 ng/ml或1～2×107 cpm/ml，探针的浓度大于50 ng/ml虽可缩短杂交所需时间，但可能会加深背景。 【放射性标记的寡聚核苷酸探针杂交】所有步骤与放射性标记的cDNA探针杂交步骤相同，但是预杂交和杂交温度为℃，洗膜温度均为室温。【非放射性标记的寡聚核苷酸探针杂交】 在℃中加热HyB杂交液，充分搅动使沉淀完全溶解，然后平衡至℃备用。 在10×10 cm膜中至少加入5 ml杂交液，排除气泡，确保膜为杂交液覆盖，在℃预杂