过敏原提取11-04-08.ppt

方案二后续步骤 所用透析袋为试剂库所领，其截流范围为8-14ku，酪蛋白分子量为20-30ku，α-乳白蛋白分子量为14147-14175u，β-乳球蛋白分子量为18277-18363u，可以进行透析。 对样品乳去除酪蛋白后，硫酸铵两步盐析法得到的沉淀用蒸馏水进行透析除盐，并进行磁力搅拌。透析过夜，期间换水3次，然后取透析液进行SDS电泳，其中浓缩胶为5%、分离胶为15%，浓缩胶中电泳电压为80V，分离胶中电泳电压为160V。电泳结束后用考马斯亮蓝染色2h，再用水脱色过夜（因为师姐没有脱色液了，所以让我用水脱色），观察胶中条带。 先对方案二处理的样品单独进行了透析，可能是用水脱色的原因或者操作过程中的一些失误，电泳后的胶中没有条带，只有一条鬼峰（图如下）。当时猜想是不是透析袋孔径与要保留的蛋白分子量接近，而造成了这些蛋白都被透析出了透析袋，进入了透析液中。 方案一后续步骤 丙酮脱脂后，加PBS浸提，所得溶液离心后的上清液用PBS液透析，并在磁力搅拌下进行，透析10h，期间换液5次，透析完后进行SDS电泳，其中浓缩胶为5%、分离胶为12%，浓缩胶中电泳电压为80V，分离胶中电泳电压为120V。电泳结束后用考马斯亮蓝染色2h，再用脱色液脱色过夜，观察胶中条带。 同时将方案二中处理的样液也一起上样，以验证自己的猜想。 所得胶的图如下，图中的小孔是我制胶时有气泡而造成的，第一列是marker，后面三列的条带分别是方案二中处理的样品和方案一中处理的样品（点了最后两个孔，分别是我加丙酮后进行了混匀操作和没有混匀操作的）。 考马斯亮蓝法测蛋白含量——标曲 配制0.1mg/mL的BSA溶液 考马斯亮蓝法测蛋白含量的操作比较繁琐，影响因素比较多，测了很多次后，才有了相对较好的线性（R2值在0.99以上）。 本想用紫外法在280nm直接测出蛋白含量，但由于紫外分光光度计坏了，也没有石英比色皿，因此只能用考马斯亮蓝法测定。考马斯亮蓝法所测蛋白浓度很低，范围又比较窄，一般透析后原液的蛋白含量都超出其线性范围，所以只能将样品蛋白稀释后再进行测定。 该法所测方案二处理的样品中蛋白浓度为0.824mg/mL，方案一处理的样品中蛋白浓度为1.26mg/mL（加丙酮后混匀）和0.283mg/mL（加丙酮后未混匀）。 河虾过敏原的提取 参照沈丽燕师姐毕业论文中的方法来提取河虾中的过敏原。 将河虾去头去尾后用组织捣碎机捣碎，称取15g，将其按1:10(W/V)的比例浸入正己烷中脱脂，磁力搅拌下混合1h后，静置分层，倒出上清液，再按上法重复浸提一次，倒出上清液，在空气中放置过夜，以使正己烷充分挥发。然后用含0.05%EDTA?2Na的预冷PBS溶液在磁力搅拌机上快速搅拌10min，4℃下静置过夜。 The work needs to be done 根据电泳所的条带进行分析，选定方法（除杂蛋白较彻底的方法）后，进行过柱分离与纯化，希望将酪蛋白、 α-乳白蛋白和β-乳球蛋白都分离开。 对河虾蛋白浸液进行硫酸铵分级沉淀和等电点沉淀以分离出河虾过敏原，在对其进行透析等步骤。 比较文献报道的鱼中过敏原，确定所用鱼的种类以及所用提取方法，初步尝试提取鱼中过敏原。 * Name: guanlu Lab meeting 11/04/08 The work was done 鬼峰 溴酚蓝条带 marker 方案二处理的样品 方案一处理的样品（前者加丙酮后混匀，后者没混匀） 由于脱色还未彻底，条带还不是特别清晰，但相比于第一张胶图已经有了条带，待其脱色彻底后，再进行分析。 75 60 45 30 15 0 每管所含BSA的量(μg) 0.592 0.500 0.400 0.285 0.148 0 吸光值A595 5 5 5 5 5 5 考马斯亮蓝体积(mL) 0.25 0.40 0.55 0.70 0.85 1.0 水体积(mL) 0.75 0.60 0.45 0.30 0.15 0 BSA体积(mL) *