基因治疗体细胞.ppt

（四）限制性核酸内切酶酶切图谱分析 （五）DNA序列测定 （六）DNA芯片技术 应用PCR-RFLP连锁分析诊断甲型血友病 用一对引物扩增凝血因子VIII基因第18对外显子内的一个142bp 的片段。该片段含有bclI的多态性位点。酶切后，如果有该酶切位点，则产生99bp和43bp的两个片段；如果不存在则只有一个142bp 一个片段。该片段与甲型血友病基因连锁。 SNP分为两种形式： 基因编码区的SNP，称为cSNP 遍布于基因组内的大量单碱基变异 血红蛋白病的诊断 血红蛋白病（hemoglobinopathy）是由于血红蛋白分子结构异常（异常血红蛋白病），或珠蛋白肽链合成速率异常（珠蛋白生成障碍性贫血，又称海洋性贫血）所引起的一组遗传性血液病。 限制性内切酶酶谱法 DNA指纹分析:针对重复序列人工合成寡核苷酸探针，与经过酶切的人基因组DNA进行Southern印迹杂交，可以得到大小不等的杂交带，杂交带的数目和分子量大小具有个体特异性，就像人的指纹一样。 几种常见的基因干预技术 反义核酸技术 核酶技术 三链DNA RNA干扰技术 反义核酸技术 反义核酸导入细胞，通过碱基互补作用与mRNA结合，阻断肿瘤细胞中基因的异常表达，以抗肿瘤、抗病毒。 反义RNA: 干扰mRNA的互补RNA; 反义DNA: 干扰DNA的互补DNA。 三链DNA：当某一DNA或RNA寡核苷酸与DNA高嘧啶区可结合形成三链，能特异地结合在DNA的大沟中，并与富含嘧啶链上的碱基形成氢键。 RNA干扰技术 RNA干扰(RNA interference，RNAi)是正常生物体内抑制特定基因表达的一种现象，它是指当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA(double stranded RNA，dsRNA)时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默的现象，这种现象发生在转录后水平，又称为转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)。 基因干预灭蚊 正常情况下，各有一半精子分别携带X染色体和Y染色体，人类和蚊子都如此。基因干预破坏X染色体，在实验中，伦敦帝国理工学院教授把外部基因转入到冈比亚按蚊体内。这组基因能够释放催化剂，识别仅在X染色体组上大量存在的特定基因序列，并将其破坏。 “转基因”雄性蚊子产生的绝大部分精子都没有X染色体，也就生不出多少雌性后代——其中95%都是雄性的。一大波“光棍”蚊子应运而生，“生儿育女”的困难可想而知。 目的基因获得的方法： 用酶切或探针杂交法从基因组DNA文库获得，从cDNA文库获取，PCR扩增，人工合成等。 （三）靶细胞的选择 生殖细胞(germ cell)基因治疗 体细胞(somatic cell)基因治疗：造血细胞、皮肤成纤维细胞、肝细胞、血管内皮细胞、淋巴细胞、肌肉细胞、肿瘤细胞等。 基因治疗的途径 （一）目的基因的获得 在了解疾病发生的分子机制基础上，选择与致病基因相对应的有功能的正常基因或与致病基因无关、对疾病有治疗作用的特定基因。 如，对单基因缺陷遗传病，可用野生型（非突变）基因用于治疗； 对于肿瘤，最好选择某些与该类肿瘤密切相关的癌基因或抑癌基因用于基因治疗。 常用的载体有两类：病毒载体和非病毒载体。 病毒载体：逆转录病毒（RV)、腺病毒（AV) 、 腺相关病毒（AAV)、单纯疱疹病毒 （HSV)和人免疫缺陷病毒（HIV)等； 非病毒载体： 与病毒载体的主要区别在于：采用理化方法将治疗基因转移入患者体内。 （二）基因载体的选择 （1）去除病毒的致病性结构的基因序列如逆转录病毒的gag、pol、env基因，从结构上保证病毒的安全性。同时产生的空白区以目的基因取而代之； （2）保留其基因的调控序列及包装序列等； （3）插入标记基因如NeoR基因以对基因转染细胞的抗性筛选等。 病毒载体构建 载体的包装 野生型病毒 病毒载体 载体DNA 包装信号 治疗基因 目的 DNA 病毒必需基因 复制蛋白 结构蛋白 包装细胞 选择的原则： (1)便于从体内取出和回输； (2)便于在体外培养与增殖； (3)便于基因的高效转移； (4)能够持续表达目的基因。 三、基因诊断的应用 遗传性疾病 感染性疾病，传染性流行病 肿瘤 法医学上的应用 判断个体疾病易感性 器官移植组织配型 三、基因诊断的应用 1.遗传性疾病：直接诊断--点突变； 间接诊断--多态性连锁分析 如：血红蛋白病和苯酮尿症的诊断 应用RFLP诊断血红蛋白病 正常人?珠蛋白121密码子 GAA