核酸分子杂交、凝胶电泳.ppt

(molecule hybridization) 分子杂交是指在分子克隆中的一类核酸和蛋白质分析方法，用已知标记的核酸分子或蛋白质分子检测混合样品中未知核酸分子或蛋白质分子，以及其相对分子量大小。 根据其检测对象的不同可分为 Southern 杂交、Northern 杂交和 Western 杂交 ，及由此简化的斑点杂交、狭线杂交和菌落杂交。 分子杂交可在DNA与DNA、RNA与RNA或RNA与DNA的二条单链之间进行，也可能在蛋白质与蛋白质之间进行。 核酸分子杂交是指核酸分子(DNA或RNA)在变性以后，在复性的过程中两个不同来源的且同源的核酸分子形成杂合双链的过程。 通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性标记的探针与被固定的分子杂交，经显影后显示出目的DNA或RNA分子所处的位置。 （一）Southern杂交的操作步骤 1.预处理： （1）用限制性内切酶将基因组DNA进行酶切。 （2）将酶切后的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳。 （3）将电流出来的那块凝胶泡在强碱溶液中，此时双链的DNA样品变成单链DNA结构。 （4）用酸中和，使单链DNA维持其单链状态 2.原位转移： 将凝胶上的单链DNA转移到滤膜上。 3.固定： 在真空烤箱里，80℃下烤1-3h。将核酸样品进一步固定在滤膜上 4.杂交： 将滤膜移在含有放射性同位素标记的探针分子溶液中，溶液上的单链DNA分子与探针分子通过互补配对进行杂交，形成杂种分子。 5.漂洗： 将滤膜上没有和单链DNA样品结合的游离的探针分子漂洗下来，此后滤膜上只有杂交分子。 6.放射自显影： 在X光曝射下进行放射自显影形成自显影图片。 7.比较鉴定： 将放射自显影图片上的谱带与凝胶上的谱带进行比较。确定与探针分子结合的DNA分子是凝胶上DNA链的那个片段。 Southern印迹杂交方法操作简单，结果十分灵敏，在理想的条件下，应用放射性同位素标记的特异性探针和放射自显影技术，即使每带电泳条带仅含有2ng的DNA也能被清晰地检测出来。 （二）Southern杂交的杂交滤膜 1.硝酸纤维素滤膜 在印迹技术中，硝酸纤维素滤膜是目前应用最广的一种固相支持物，但它存在一些不足之处: （1）硝酸纤维素滤膜是依赖疏水性相互作用结合DNA的，这种结合并不十分牢固，随着杂交及洗膜进程，DNA会慢慢脱离硝酸纤维素滤膜，从而使杂交效率下降。 （2）硝酸纤维素滤膜质地较脆弱，容易碎裂，因此操作须小心谨慎 (特别是经烘烤后)。 （3）硝酸纤维素滤膜与核酸的结合有赖于高盐浓度，在低盐浓度时结合DNA效果不佳，不适宜于电转印迹法。 （4）硝酸纤维素滤膜对于小分子质量的DNA片段 (特别是小于200bp的DNA片段)结合能力不强。 2. 尼龙膜 优点： 结合DNA和RNA的能力强于硝酸纤维素滤膜，对小分子质量的核酸也能较好地结合。 尼龙膜韧性强，操作较方便，对离子浓度要求不高，可重复用于杂交。 缺点： 杂交信号本底较硝酸纤维素滤膜高。 Northern杂交的过程 ①提取总RNA。 ②分离mRNA。利用亲和层析的原理纯化mRNA。 ③制备RNA探针。根据mRNA序列合成同源DNA探针，或以cDNA为探针。 ④Northern杂交。Northern杂交的方法包括点杂交和印迹杂交，两者都能鉴定外源基因是否得到转录，但后者还能确定mRNA分子质量大小及丰度。 三 菌落原位杂交 （colony in situ hybridization） 1975年，M.Grunstein和D.Hosnese根据检测重组子DNA分子的核酸杂交技术原理,对Southern印迹技术作了一些修改,提出了菌落原位杂交技术。该项技术是直接把菌落印迹转移到硝酸纤维素滤膜上,经溶菌和变性处理后使DNA暴露出来并与滤膜原位结合,再与特异性DNA探针杂交,筛选出含有插入序列的菌落。 菌落原位杂交的操作步骤 四 Western杂交 是将蛋白质电泳、印迹和免疫测定结合在一起的检测方法，具有很高的灵敏度，可从总蛋白中检测出50ng的特异性表达蛋白。 蛋白质混合样本经过SDS电泳后，分离为不同的条带，其中含有能与特异性抗血清或单克隆抗体相应的待检测蛋白质（抗原蛋白）。 电转印：将PAGE胶上的蛋白质条带转移到NC膜上（粗糙面贴在胶上）。 将NC膜与抗血清一起孵育，使抗血清（一抗）与特异蛋白条带结合， 再与经过荧光素、酶或同位素标记的二抗反应， 可检测出样品中待检抗原及其含量。 ◆ Southern印迹法(DNA印迹法,Southern blotting)：是一种把DNA电泳分离区带转移到支持膜上的技术。因这一技