酶的定向分子进化.pptx

酶的定向分子进化;酶的定向分子进化简介;酶的定向分子进化简介;单一/一组基因;该进化策略有以下三个显著特征： A.进化的每一关键步骤都受到严密控制 B. 可引入一个全新的功能，来执行从不被生物体所要求的反应，甚至为生物体策划一个新的代谢途径 C.能从进化结果中探索蛋白质结构和功能 ;不需要了解酶的空间结构和催化机制;1.易错PCR;该方法关键在于选择适当的突变频率，一般为每个基因2-5个碱基替换。另外，迭代错误倾向PCR可使小的有益突变累积而产生大的提高。尽管这种方法已有不少成功的例子。但毕竟遗传变化只发生在单一分子内部，属于无性PCR进化范畴。 ;2.DNA shuffling;3.StEP重组;第一次退火、延伸;4.随机引物体外重组法;与DNA shuffling相比，RPR具有以下优点：a.可用单链DNA或mRNA为模板，且对模板量要求少。b.克服了DNA shuffling中DNase所具有的序列偏爱性，保证了子代全长基因中突变和交叉的随机性。c.片段组装体系与片段合成体系缓冲系统可兼容，组装前无需纯化操作。d.随机引发DNA合成不受模板DNA长度的限制，便利了小肽的改造。;5.过渡模板随机嵌合生长;6.渐增切割法产生杂化酶;α-硫代磷酸核苷酸介导法（ITCHY）：首先将待重组的两基因串联在同一载体上，然后通过PCR反应或单链模板引伸反应将α-硫代磷酸核苷酸随机引入产物中，由于其抗核酸外切酶Ⅲ的切割，接下来的切割反应会在此处随机终止，连接切割产物即产生随机交叉文库;3.易错PCR技术的应用;易错PCR获取突变脂肪酶基因：以实验室构建的pPIC3.5K-PEL重组质粒为模板，P1、P2为引物连续两轮随机突变脂肪酶基因PEL。第一轮易错PCR扩增(100 mL体系)见右图。反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，55℃退火30 s，72℃延伸1 rain，共32个循环；72℃最后延伸7 min。电泳鉴定回收。 ;稀释第一次易错PCR回收的突变脂肪酶基因，并以其为模板，控制浓度在1μg/μL-10μg/μL范围内，以P1，P2为引物，进行第二轮易错PCR。第二轮易错PCR的反应体系参照第一轮，但反应条件稍作变化：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72℃延伸1 min，共32个循环；72℃最后延伸7 min。1％琼脂糖电泳确认PCR结果后，再次使用回收胶，进行突变脂肪酶基因的回收。;3突变脂肪酶重组表达载体构建：使用EcoR I、BamH I分别对突变脂肪酶基因、 PIC3.5 K质粒进行双酶切。按照1：10的比例，将回收的突变脂肪酶基因片段和pPIC3.5 K线性质粒用T4DNA Ligase连接，构建突变脂肪酶基因的重组表达载体。;获得脂肪酶基因随机突变库:将重组质粒转化到感受态的大肠杆菌E.coli DH5α，确定转化后平板长出单菌落，用含100μg／mL氨苄青霉素的LB液体培养基将大肠杆菌菌落刮下，获得脂肪酶基因突变库，加入等体积的30％甘油混合，80℃保存。 ;突变脂肪酶在毕赤酵母的表达：大量抽提突变脂肪酶重组表达载体pPIC3.5K-EP-PEL，并用SalⅠ酶，37℃酶切过夜。乙醇沉淀法回收线性化载体。采用电击法将线性化载体转化到新鲜制备的毕赤酵母GS115感受态细胞中。;突变脂肪酶的初筛：电击转化后，将YMD板上长出的毕赤酵母单克隆，全部点印至YPOM固体平板上，并标上序号。恒温培养箱30℃培养，观察每个茵落产水解圈情况。每个YPOM固体平板点印一个产野生型脂肪酶的菌落做对照。比较每个菌落水解圈大小。挑取并标记产水解圈，且水解圈大于对照菌落的突变菌株，YPD液体培养基活化，并甘油保菌，用于下一步复筛。;突变脂肪酶的复筛：YPD液体培养基活化后的酵??菌转接至MGY液体培养基中扩增。当菌液OD600达到2-6时，即可将菌体转接MMY培养基。收集一定体积的MGY培养物，4℃，4000 rpm，离心5 min，去除MGY培养基，将菌体转移到MMY培养基中诱导产酶。;称取2.0g琼脂，加入100 mL 0.05mol／L pH9.4缓冲液，微波炉溶解后，加入2mL橄榄油乳化液，混合均匀，制成橄榄油检验板。打孔器打孔，将发酵上清液点入孔中，观察水解圈产生情况。野生型脂肪酶液PEL-GS为对照。选取水解圈较大的菌株进行突变脂肪酶理化性质鉴定。 ;突变脂肪酶理化性质鉴定:NaOH法测定脂肪酶酶活力。扩展青霉碱性脂肪酶在碱性条件下，可以将橄榄油水解成甘油和脂肪酸，生成的脂肪酸再用标准的碱溶液滴定，以滴定值表示酶活力。