基因工程的操作过程.pptVIP

A DNA的体外重组（切与接） B 重组DNA分子的转化和扩增（转与增） C 转化子的筛选和鉴定（检） C 转化子的筛选和鉴定（检） 克隆DNA序列检测 限制性酶切图谱法 全酶解图谱法： pUC18 2.7 kb HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI Apr lacZ’ ori S S B P 4.0 kb 1.0 kb 0.8 kb 区分重组子与非重组子 如果外源DNA片段插在pUC18的SphI位点处，原则上也可用SphI酶解鉴定，但这样做很不经济，因为SphI非常昂贵（每100单位50美元）。用HindIII和EcoRI联合酶解同样可以达到目的，但这两种酶的价格只及SphI的1 / 50 克隆DNA序列检测 限制性酶切图谱法 全酶解图谱法： pUC18 2.7 kb HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI Apr lacZ’ ori B B E P 4.0 kb 1.0 kb 0.8 kb 区分目的重组子与非目的重组子 用EcoRI酶切转化子质粒DNA 目的重组子： 3.0 kb + 3.7 kb 或者： 1.0 kb + 5.7 kb 用PstI酶切转化子质粒DNA 目的重组子： 3.2 kb + 3.5 kb 或者： 0.8 kb + 5.9 kb 克隆DNA序列检测 限制性酶切图谱法 全酶解图谱法： pUC18 2.7 kb HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI Apr lacZ’ ori B B E 4.0 kb 2.0 kb 2.0 kb 区分目的重组子与非目的重组子 对图示的克隆片段，转化子质粒DNA用EcoRI酶切开后，只出现2.0 kb和2.7 kb两条带子，实际上2.0 kb的条带中含有两种不同的分子 2.7 kb 2.0 kb E 克隆DNA序列检测 限制性酶切图谱法 部分酶解图谱法： 2.2 kb PstI EcoRI BamHI B B E 4.4 kb 1.2 1.8 kb E B 0.6 0.8 该重组质粒经酶解后，分别得到下列几组数据： BamHI全酶解：0.6 0.8 1.8 3.4 kb BamHI+EcoRI全酶解：0.6 0.8 1.8 1.2 2.2 kb 其中，1.2 kb片段的存在表明该片段位于一端 BamHI部分酶解：1.4 2.6 4.0 kb 其中，1.4 kb的片段必为0.6 kb和0.8 kb两片段，表 明两者是连在一起的；同理，2.6 kb的片段必为0.8 kb和1.8 kb两片段，表明两者是连在一起的；最后， 4.0 kb的片段必为0.6 kb和3.4 kb两片段，表明两者 是连在一起的 克隆DNA序列检测 菌落噬菌斑原位杂交法 菌落或噬菌斑原位杂交法的工作原理是根据克隆的目的基因或DNA片段的同源序列设计并合成探针，以此搜寻筛选含有目的基因的目的重组子。其中，DNA同源序列之间的特异性互补杂交是该技术的基本理论依据 克隆DNA序列检测 菌落噬菌斑原位杂交法 菌落原位杂交法的基本操作： 影印 用硝酸纤维素薄膜影印克隆平板 洗涤 杂交 感光 用0.4N的NaOH溶液浸泡影印薄膜 用SSC溶液浸泡清洗影印薄膜 80℃烘干固定影印薄膜 薄膜置于含有探针的杂交溶液中保温 用SSC-SDS液洗涤杂交薄膜 用X光胶片覆盖薄膜感光 克隆DNA序列检测 菌落噬菌斑原位杂交法 杂交探针的制备： 用于菌落或噬菌斑原位杂交的探针必须满足下列条件： 单链结构（双链DNA可用碱变性） 足够长度（至少12个碱基） 内部不含互补区 探针的制备方法或来源包括： 人工合成 cDNA合成 同源序列 mRNA 克隆DNA序列检测 菌落噬菌斑原位杂交法 杂交探针的标记：T4-PNP介导的末端标记 5‘ HO 3‘ HO OH 3‘ OH 5‘ T4-PNP Mg2+ pppATP（g-32P-ATP） 5‘ p 3‘ HO OH 3‘ p 5‘ 克隆DNA序列检测 菌落噬菌斑原位杂交法 杂交探针的标记：逆转录酶介导的反转录标记 3’AAAAAAAAAAACCAGCTTCC···GAACTGATTTAGGCT 5’mRNA 反转录酶 Mg2+ dNTP + pppdATP（a-32P-dATP） 5’TTTTTTTTTTT 5’mRNA 3’cDNA 3’AAAAAAAAAAACCAGCTTCC···GAACTGATTTAGGCT 5’TTTTTTTTTTTGGTCGAAGG···CTTGACTAAAT