实验五人淋巴细胞的培养.jsp.pptVIP

一、实验目的 熟练掌握RPMI 1640培养基的配制方法。 二、实验原理 细胞培养使用的培养基一般是由合成培养基和小牛血清配制而成。合成培养基有商品出售，它是根据细胞生长的需要按一定配方制成的粉状物质。其主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子和其他辅助物质。它的酸碱度和渗透压与活体内细胞外液相似。 小牛血清含有一定的营养成分，更重要的是它含有细胞生长所必需的生长因子；酶、微量元素和激素；保护作用；提供伸展和贴附因子等，是合成培养基所无法替代的。此外它还能中和有毒物质（重金属、抗菌素）的毒性。 氨基酸是组成蛋白质的基本单位。不同种类的细胞对氨基酸的要求各异，但有几种氨基酸细胞自身不能合成，必须依靠培养基提供，这几种氨基酸称为必需氨基酸。其中谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。因此，各种培养液中都有较大量的谷氨酰胺。但是，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应置于-20℃冰箱中保存，在使用前加入培养液内。 三、仪器、材料和试剂 超净工作台 高压灭菌锅 多重蒸馏水器 磁力搅拌器 天平 微量加样器 （二）用具、材料 细胞培养瓶 量筒、研钵、烧杯、漏斗、滤纸 pH试纸 微孔过滤器（0.22μm）及注射器 各种规格的Tip 、离心管 （三）试剂 NaOH、 酚红 RPMI 1640干粉 小牛血清、青霉素、链霉素 NaHCO3 、L-谷氨酰胺 三蒸水 要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求： 一是供给细胞存活所必需的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度和渗透压的调节。 二是严格控制无菌条件。 四、实验步骤 （一）准备(清洗与灭菌） （二）合成培养基的配制 1. 1%酚红： 配制 0.1 mol/L NaOH 100ml。 称量 1g 酚红于研钵中，取 30 ml 0.1 mol/L NaOH逐渐加入研钵中，尽量研细，然后过滤。 过滤后的酚红液加三蒸水至 100 ml。 4℃保存。 2. 饱和NaHCO3的配制： 称取 10g 的 NaHCO3 溶于 200 ml 三蒸水中，灭菌后分装于50 ml 试剂瓶。 4℃保存。 3．RPMI 1640 培养液配制： 配制50ml RPMI 1640培养液： 每组称取 RPMI 1640干粉 0.52g，溶于50 ml 的三蒸水。 置于搅拌器上搅拌 20 min，直到液体变为澄清为止。 4. RPMI 1640 合成培养基配制： 加入 0.1ml 1%的酚红，通入CO2，使液体变为金黄色，说明培养基完全溶好。 配制好的培养基，用时用饱和 NaHCO3液调节 pH 至 6.8-7.0。 溶好以后的培养液在超净台中进行0.22μm滤过除菌，分装至细胞培养瓶中。 瓶口封好，-20℃或4 ℃贮存。 （三）小牛血清的处理 新买的新生小牛血清一定要灭活。 将买来的新生小牛血清不开封置于水浴锅中56℃，30min，期间要不时轻轻晃动，使受热均匀，防止沉淀析出。 处理后的血清贮存于4℃。 （四）生长培养基的配制 1．双抗： （100000U/ml） 160万单位青霉素/瓶+8ml 3DW = 20万单位/ml 1g链霉素+5ml 3DW = 200000 μg /ml 各取以上的液体5ml混合，使其浓度为10万单位/ml，0.22μm 过滤至1.5ml离心管，-20℃贮存。 2．谷氨酰胺储备液（200mmol/L）： 1.5g的谷氨酰胺溶于50ml三蒸水中 （30 mg/ml= 200 mmol/L),0.22μm过滤至1.5ml离心管中。 -20℃贮存。 3. RPMI 1640生长培养基的配制 六、思考题： 血清在细胞培养中有何作用？ 为什么配制培养基之前要反复处理配制用水并要事先高压处理？ 配制培养基时调节pH值的目的是什么？ * * 实验五 人类淋巴细胞株培养 ——培养基的配制 小牛血清 L-谷氨酰胺 （一）仪器 注意 磁珠 10% — 5 小牛血清 100u/ml 100000u/ml 0.05 双抗 0.3mg/ml 30mg/ml 0.5 谷氨酰胺 — — 44.5 RPMI 1640培养液 终浓度 储备液浓度 50毫升