乳腺癌基因治疗研究进展-课件.pptVIP

* BALB/c裸鼠移植瘤的病理形态学检测 A B D A：DMEM 组； B：GCV+Dox 组； C：GCV+病毒组； D：Dox+GCV+病毒组 C 乳腺癌自杀基因调控治疗的问题与展望 靶组织特异性 调控特异性 杀瘤有效性 * * Dox 浓度对 MCF/TRE/tk/Tet-On 细胞生长的影响 图 5 GCV 浓度为 1 μg/ml 时，不同浓度 Dox 对 MCF/TRE/tk/Tet-On 细胞存活数的影响 * 旁观者效应 表 1 MCF/TRE/tk/Tet-On 细胞旁观者效应的克隆记数 1组(n=4) 2组 (n=4) 3组 (n=4) 4组 (n=4) 5组 (n=4) 6组 (n=4) MCF-7 100% 95% 90% 75% 50% 0% MCF/TRE/tk/Tet-On 0% 5% 10% 25% 50% 100% 克隆计数(均值±SE) 36.0±0.81 34.0±0.81 4.5±0.65 5.0±0.71 5.0±0.58 3.5±0.50 * 可调控性自杀基因乳腺癌动物模型的建立 以表达 HSVtk基因及调控系统 Tet-On 的乳腺癌细胞 MCF/TRE/tk/Tet-On 直接接种SCID 小鼠成功建立了可调控性自杀基因乳腺癌动物模型，为探讨自杀基因体外调控机制的研究奠定了基础。 * SCID小鼠体内成瘤及治疗前后肿瘤大小的变化 图 6 乳腺癌细胞 MCF/TRE/tk/Tet-On 接种 SCID小鼠后，NS组、GCV组、GCV+Dox组 SCID小鼠肿瘤体积的变化 * SCID小鼠肿瘤组织病理学观察 图 7 三组 （NS组、GCV组、GCV+Dox组）SCID 乳腺癌小鼠 经治疗15天后肿瘤组织病理学观察 H-E染色（×250） NS 对照组; GCV 治疗组; Dox+GCV 治疗组 * RT-PCR 检测 SCID小鼠肿瘤组织 HSVtk的表达 M 1 2 3 图 8 RT-PCR 检测各组 SCID小鼠肿瘤治疗15天后 HSVtk的表达 M: 100bp Marker; 1. GCV治疗组; 2. Dox+GCV治疗组; 3. NS 对照组 * 研究背景 逆转录病毒载体用于 ex vivo基因治疗，实际感染效率低。 原因: 一、感染正在分裂的细胞； 二、获得病毒滴度低； 三、病毒半衰期短，移动距离有限, 在一个半 衰期内大多数病毒不能到达靶细胞。 重组逆转录病毒介导的 HSVtk基因 表达及提高逆病毒滴度的初步研究 * 逆转录病毒的纯化 将初步浓缩的病毒液经冷冻干燥去除更多的水分，以小体积的缓冲液（DMEM）复溶后－70℃冻存得到浓缩病毒液。 * 产毒 PA317 阳性细胞克隆筛选培养 图 14 微乒乓感染 pRevTRE/ HSVtk、 pRevTet-On 、pRevTRE 载体的 PA317 细胞经潮霉素B、G418 筛选2周后形成的抗性克隆 (×100) * 不同培养时间与重组病毒滴度的关系 图 9 不同培养时间对克隆 PA317 细胞产生重组 病毒滴度的测定 * 不同丁酸钠浓度和重组病毒滴度的关系 0 5 10 15 20 图 10 不同丁酸钠浓度下对克隆 PA317 细胞培养 30h 产生重组病毒滴度的测定 * SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测有无病毒蛋白表达 图 11 克隆 PA317 细胞上清 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 M： 蛋白质分子标准； Lane 1： pRevTRE DNA转染 PA317 30 h 后细胞上清； Lane 2： pRevTRE/tk DNA转染 PA317 30 h 后细胞上清 * PCR 检测克隆的细胞上清有无 HSVtk 基因插入片段 1, 240 bp 图 12 转染 PA317细胞上清 PCR 扩增 HSVtk 基因 M： 100 bp DNA 标准物； Lane 1：pRevTRE/tk DNA转染 PA317 30 h 后细胞上清； Lane 2：pRevTRE DNA转染 PA317 30 h 后细胞上清 * RT-PCR 检测被逆转录病毒浓缩液感染的 MCF-7 细胞中