激光共聚焦显微镜原理和操作技术总结.ppt

程序化测量：用timelapse中的编程按钮可进行不同时间序列的扫描测 量。 ?F/F=(F-Fbase)/(Fbase-FBG) Ca2+浓度绝对测量 1）单波长公式法 Fluo3: 530nm Kd=450nM [Ca2+]I =Kd(F-Fmin)/(Fmax-F) Fmin: 细胞内无钙时的荧光强度( MnCl2) Fmax：细胞内钙饱和时的荧光强度(A23187) 测量时切记细胞内静息Ca2+浓度的相对荧光强度值不能太低（F值不低于40） 激光扫描共焦显微镜应用 细胞内生理Ca2+浓度值（10-8 -10-7 M） 细胞内Ca2+超载浓度值（基础Ca2+浓度的10倍左右） 2）标准曲线法 根据仪器条件和负载条件，以不同Ca2+浓度的Buffer(EGTA- Ca2+)做标准曲线，横轴为Ca2+浓度，纵轴为荧光强度 3）比例荧光的测量 .双波长(比例荧光：ratio) Indo1(360, 420/480), fura2(340/380, 440) [Ca2+]I =Kd(R-Rmin)/(Rmax-R)Ff2/Fs2 激光扫描共焦显微镜应用 激光扫描共焦显微镜应用 快速Ca2+变化的测量 1.改变扫描速度 2.采用双向扫描 3.减少采样点数(牺牲空间分辨率） 4.采用线扫描(xt) 细胞器的Ca2+测量 1.线粒体内游离Ca2+测量 Fluo-3 + TMRM(线粒体荧光探针，红色） 2. 特异定位的重组水母发光蛋白 水母发光蛋白与 Ca2+结合后发蓝光 用含有水母发光蛋白和含有特定细胞器蛋白的表达载体转染细胞，可测定亚细胞器内的游离Ca2+变化 目前已商品化的探针可检测：线粒体、内质网、细胞核内的游离Ca2+，因生物发光很弱不能使用Confocal检测 激光扫描共焦显微镜应用 细胞内游离Ca2+测量的应用 钙的特性 1．细胞内外的电化学梯度103-104倍 2．细胞膜渗透性稍有改变或钙库释放稍有增加，导致 胞内钙明显升高 3．细胞内钙为细胞激活“开关” 细胞内钙的生理作用 1．肌肉的兴奋收缩-收缩偶联 2．神经递质的释放 3．学习记忆的增强 4．卵子受精 5．细胞分裂和再生 6．细胞调亡 7．细胞间通讯 激光扫描共焦显微镜应用 8．细胞信号传导 9. DNA合成 10. 基因表达 细胞内钙超载与疾病 1．高血压、脑缺血、心脏病、内分泌病—胞内钙浓度异常 2．糖尿病、风湿性关节炎、多发性硬化病—胞内钙浓度增高 3．人体缺钙—骨钙大量丢失，神经细胞的钙浓度增高 4．老化和老年性痴呆-神经细胞内钙浓度增高 细胞内生理Ca2+浓度值（10-8 -10-7 M） 细胞内Ca2+超载浓度值（基础Ca2+浓度的10倍左右） 激光扫描共焦显微镜应用 电刺激引起骨骼肌 细胞的Ca2+振荡 激光扫描共焦显微镜应用 激光扫描共焦显微镜应用 pH值的检测： BCECF-AM 490nm 530nm 6.5-7.5 Snarf-1-AM 488nm 580/640nm 7.0-8.0 自由基的检测 荧光探针：H2DCF-DA（504nm/529nm） 2-氢，2氯荧光素乙酰乙酸盐 胞外H2DCF-DA 扩散入细胞内 酯酶脱乙酰 DCF-H(不荧发光） DCF（发荧光） *样品不能在镜下用汞灯照射及观察 Dihydrorhodamine 123（507nm/529nm） H2rhod123 被动扩散入细胞内 在细胞内被氧化成rod123（发光） 激光扫描共焦显微镜应用 激光扫描共焦显微镜应用 药物进入细胞的动态过程及定位分布 xyzt 扫描 激光扫描共焦显微镜应用 四. 膜电位的测量 标记膜电位探针(慢反应）： JC1 510nm 530/590nm Dioc5(3) 548nm 573nm Dioc6(3) 484nm 500nm 快反应探针： Di-4-ANEPPS 496nm 703nm Di-4-ANEPPS 498nm 713nm 细胞膜静息膜电位：-70mV 线粒体膜电位：-150mV 以上均属于阳离子探针，更容易与线粒体亲和，为线粒体膜电位探针 激光扫描共焦显微镜应用 七．荧光能量共振转移( fluorescence Resonance Energy Transfer) 能量转移：能量从分子的一个部位向另一个部