高分辨率溶解曲线HRM1.ppt

第二类是酶切。步骤繁琐，费时，检测已知SNP。结果不稳定。 第三类方法中包括测序、Pyrosequencing等技术。此外还有芯片等技术可用于SNP分析；Pyrosequencing技术它既可进行DNA序列分析，又可进行基于序列分析的SNP检测及表观遗传学甲基化的分析以及大规模的等位基因频率测定 。 HRM主要特点 高分辨率溶解曲线（高分辨溶解曲线突变检测）是理想的SNP检测手段： 快速、高通量—LightScanner 5分钟完成96/384孔板的PCR产物检测， 20000个SNP/天 准确、灵敏度高、特异性好—LightScanner100%准确性、特异性（400bp）；准确性96.4%和特异性99.1%（400~1kb） 重复性好—LightScanner重复性100% 费用低—LightScanner检测SNP每个样品的成本为1RMB 操作简便—LightScanner只需将PCR产物（96/384孔板）放入仪器内便可，软件自动基因分型 Nucleic Acids Research,2009,Vol.37,No.12 HRM   _____一种用于突变扫描和基因分型的遗传学分析方法 高分辨率熔解曲线(high resolution melting)是在实时荧光PCR基础上发展起来的一种新的实时定量新技术。 常规Real-time PCR利用SYBR Green染料标记DNA双链，但是SYBR Green是一种大分子即不饱和染料，不能保证PCR产物全部的小沟都嵌合上SYBRGreen，并且嵌合到产物中的染料如果在扩增过程中不能及时脱落，还会抑制PCR反应。 HRM采用新型的饱和染料如LC Green， SYTO 9等。不仅没有不饱和染料的缺点，而且更易于检测单碱基突变、小片段插入或缺失。 方法 在PCR反应前将LC Green饱和荧光染料与 PCR反应体系混合，然后将PCR产物直接放入LightScanner、HR-1或Rotor-Gene 6000仪器中，在一定的温度范围内将PCR扩增产物进行变性，就是对PCR的扩增子进行加热，温度从50°C逐渐上升到95°C。在此过程中，扩增子逐渐解链。在HRM分析的初期，荧光强度很高，随着温度升高，双链DNA逐渐减少，荧光强度也就下降了。HRM仪器通过照相机，记录下荧光变化的整个过程。通过对数据的作图，就生成了熔解曲线 。 原理 HRM是通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR产物的结合情况。SNP位点碱基不同会使双链DNA的TM值发生变化从而双链DNA在升温过程中先后解开，形成不同的融解曲线形状，荧光染料从局部解链的DNA分子上释放，从荧光强度与时间曲线上就可以判断是否存在SNP，而且不同SNP位点、杂合子与纯合子等都会影响熔解曲线的峰形，因此HRM分析能够有效区分不同SNP位点与不同基因型。 条件要求 1、高分辨率：扩增子的熔解曲线完全取决于DNA碱基序列。序列中如有一个碱基发生了突变，都会改变DNA链的解链温度。但是这个差异极小，只有零点几摄氏度，如果仪器的分辨率不高，是根本无法检测的。那么什么样的分辨率才是高分辨率呢？根据仪器现有的功能测试，在熔解操作时每摄氏度至少要获得10个数据点，这是对仪器的最低要求。此外，温度均一性也同样重要。如果两孔之间温度相差0.1°C，就很可能导致最终的熔解温度相差0.1°C，这样就无法保证HRM分析结果的准确性。 2、饱和染料：为什么要饱和染料呢？因为饱和染料饱和了DNA双螺旋结构中的小沟，在DNA解链过程中就不会发生重排，荧光信号能准确的反映DNA的解链。这样熔解曲线才有了更高的分辨率。 HRM在分子诊断中的应用 基因分型 突变扫描 甲基化分析 序列配对 基因分型 传统的基因分型方法或者耗时费力，或者需要购买价格不菲的探针。HRM分析无需制备探针；有了饱和染料，PCR产物全程被标记，因此所有的熔解区域都能检测到。对于同一扩增子内的不同杂合体，通过曲线形状的差异也能区分开。 HRM已经在人类(双倍体)和微生物(单倍体)的基因分型中得到应用．人类疾病基因包括球蛋白、囊肿性纤维化、V因子、凝血素、血色沉着病蛋白、血小板抗原、乳糖分解酵素和MGMT启动子区域的甲基化．微生物基冈有：hsp65、16s rRNA基因、gyrA等． SNP相关研究方法比较： 目前突变/SNP的研究手段大致有三大类， 一类是以荧光共振能量传递为基础的检测方法，比如Taqman探针法。显著特点是速度快，通量大。缺点是只能检测已知SNP，昂贵。 突变扫描 目前应用HRM进行突变扫描的基因有：C-kit、乙酰辅酶A脱酶的中链、原肉毒碱缺乏症、RET、表皮生长因子受体EGFR、K—ra