利用ctl表位替换方法构建新型乙肝疫苗 - 第三军医大学学报.doc

利用重叠PCR实现乙肝表面抗原CTL表位的替换( 王文敬1,黎诚耀1,李明松2（南方医科大学：1.生物技术学院，2.南方医院消化科，广州510515） 摘 要目的(glypican-3，GPC3)的CTL 表位EYILSLEEL替换HBsAg中内源性CTL表位LLD，构建用于预防和治疗乙肝的DNA疫苗。以为模板，应用重叠延伸PCR 扩增出含EYILSLEEL表位的HBsAg基因 HBsAg，将其插入pBSK+载体中，构建出pBSK/GPC3载体。，利用DNA 重组技术将其定向插入真核表达载体pcDNA3.1+真核表达载体经酶切和测序鉴定构建表达表位EYILSLEEL。结果了表达EYILSLEEL真核pcDNA3-GPC3/HBsAg。结论 成功构建pcDNA3-GPC3/HBsAg真核表达。 关键词表位重叠延伸PCR　 WANG Wen-Jing1, LI Cheng-Yao1 ,LI Ming-Song2（1School of Biotechnology, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China; 2Dept.of gastroenterology, Nan Fang Hospital, Guangzhou 510515, China） Abstract Objective This paper was to make a HBV vaccine by replacing CTL epitope of HBsAg with EYILSLEEL of GPC3 antigen. Methods The GPC3/HBsAg DNA was amplified by SEOing PCR from pcHBsAg plasmid and linked into pBSSK+ vector to construct pBSSK/GPC3 vector. pBSSK/GPC3 vector was identified by PCR, double digesting and sequencing. Then the fragment with GPC3 CTL epitope EYILSLEEL was obtained by double digesting the plasmid pBSSK/GPC3 and then inserted into pcDNA3.1+ vector. Results Sequencing is correct. Eukaryotic expression vector pcDNA-GPC3/HBsAg was constructed successfully. Conclusion The construction of eukaryotic expression vector pcDNA-GPC3/HBsAg provided a solid experimental foundation for further studies on the GPC3-HBsAg multiple peptides vaccine for HBV infection. Key words: epitope shift; glypican-3; CTL epitope; SOEing PCR SOEing(gene splicing by overlap extension)，即重叠区扩增基因拼接法，PCR 技术衍生出的一种基因融合和定点突变的有效方法[1] 。由于引物只需要与模板有效结合，5’端序列不必与模板完全配对，5’端可以添加1种甚至是2种酶切位点，以便于后期克隆。SOEing 法正是利用这一特点，，3’[2，3]。 乙肝表面抗原（HBsAg）疫苗无需免疫佐剂即能诱导出高效而特异的细胞免疫和体液免疫HBsAg具有减毒活病毒疫苗的免疫原性，本身不能复制，无感染性探索以特异性的外源基因插入或以外源CTL表位替代HBsAg上特异性的内源CTL表位在体内诱导出高效而特异的细胞免疫，目前正成为全球研究的热点。HBsAg这种新型载体，针对肿瘤病原体的为一种安全、有效的工具，。1　材料与方法 1. 1　材料　和质粒α菌种为本实验室保存真核表达载体、dNTP和限制性内切酶Not、及T4 DNA 连接酶购自 公司引物由公司合成 1. 2　　改进的FLG、LLD、SIL等CTL表位。　引物　’和3’端均包括EYILSLEEL表位序列。替换序列 5’引物WJF:TACATCCATGAGCCTGGAGGAGCTGGTGTGCCCCCTGATCCCCGGCAGC;替换序列 3’引物WJR: CTCCTCCGAGGCTCAGGATGTACTCCACCAGC