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谢谢大家！ 数据库搜索：小结 数据库搜索算法的目标是在数据库中寻找与二级质谱图最好匹配的多肽 （两个步骤）。 但是实际的二级质谱并不是那么完美的，存在很多随机匹配的可能 （打分） 估计FDR是鉴定多肽过程中非常重要的一步 通过数据库检索进行多肽鉴定后，还要根据多肽序列进行蛋白鉴定 小练习3一次实验共鉴定到了13个多肽，蛋白A-J包含这些多肽序列，请问样品中包含哪些蛋白 Molecular Cellular Proteomics 4:1419-1440, 2005 Protein inference problem in shotgun proteomics Protein isoforms are usually not distinguishable 奥卡姆剃刀原理 如果你有两个理论，它们都能解释观测到的事实，那么你应该使用简单的那个，直到发现有直接的证据支持更为复杂的那个理论。 找到最少的一组蛋白，包含鉴定到的全部多肽序列 事实是，样品中的蛋白介于可推断出的最少和最多的两个蛋白list之间 Usually，proteins are reported in groups and families 蛋白鉴定的可信度 拥有更多高可信度多肽的蛋白的可信度最高 选择至少有两个肽的蛋白，或者保留单肽鉴定的蛋白，但要求这个肽具有极高的可信度 可用反相数据库方法估计Protein FDR，也可用其它基于概率的方法，Protein FDR通常大于peptide FDR 蛋白质鉴定：小结 目的：高可信地鉴定出样品中存在的蛋白/多肽，并估计其FDR 对未知的蛋白质样品，没有标准答案 不同软件给出的结果差别很大，FDR是一个客观的标准 不同搜索引擎的比较 Molecular Cellular Proteomics,?12,?2383-2393. 合并多个软件的结果可获得更多的鉴定 蛋白质组学研究的目标 蛋白质鉴定√ Top-down策略（质量纹方法，MS谱图） Bottom-up策略（de novo测序和数据库检索，MS/MS谱图） 蛋白质修饰 蛋白质定量-相对定量、绝对定量 样品间比较 蛋白质功能 多肽的修饰 有生物学的意义修饰，如磷酸化 实验过程引入的修饰 解释更多的谱图，提高鉴定率 定量蛋白质组学采用的同位素标记 序列突变，也可用鉴定修饰的方法鉴定 固定修饰和可变修饰 固定修饰，样品中所有的肽均具有的质量改变，如用重同位素培养的细胞样品，在样品处理过程中引入的半胱氨酸还原烷基化的修饰 可变修饰，中只有一部分肽具有这个修饰，另一部分保持未被修饰的形式，大部分的翻译后修饰都属于此类。 数据库检索方法鉴定可变修饰 以磷酸化为例，磷酸化修饰有三个可能的位点，S,T,Y. 对序列AASDTNYK，在鉴定可变修饰时，共有23种可能的形式 数据库检索方法通过扩大数据库的方式进行可变修饰的检索，数据库随着可变修饰的增加呈几何级数的增长 AASPDTNYK AASDTPNYK AASDTNYPK AASPDTNYPK AASDTPNYPK AASPDTPNYK AASDTNYK AASPDTPNYPK Mascot result * 增加可变修饰的代价 时间的代价 任务 所需时间 用Mascot进行常规蛋白质鉴定 约10小时 用Mascot进行蛋白质鉴定，考虑三个常见的翻译后修饰 约3天 用PEAKS全面鉴定样品中的翻译后修饰和突变 约14天 以一次尿蛋白质组实验为例，共约100万张二级质谱图 增加可变修饰的代价 扩大的检索空间增大了随机匹配的概率，为了控制FDR，必须要采取更高的阈值，有时反而会降低鉴定的灵敏度 因此，推荐限制可变修饰的个数，只检索已知在样品中以较高比例存在的修饰 另一种策略 第一步：只考虑最少的可变修饰进行检索，目的是鉴定样品中哪些蛋白存在 第二步：将鉴定到的蛋白作为新的数据库，穷尽地检索可能存在的可变修饰，如mascot的error tolerance search，可检索全部UNIMOD收录的修饰 第三步：手工检查结果 翻译后修饰的位点 发表翻译后修饰蛋白质组学的结果，要求提供 修饰位点 位点的可信度评价 二级质谱图 磷酸化位点是T1还是T3？ Still not be sure Search for known sites * Site determination in MASCOT 小结 常用扩大检索数据库的方法鉴定多肽的修饰，检索时应尽量限制可变修饰的个数，或进行预检索 鉴定修饰的位点很重要，也是个难点 参考资料 Textbook Computational Methods for Mass Spectrometry Proteomics Ingvar Eidhamm