卫生化学首都医科大学 - 首都医科大学公共卫生学院.PPT

卫生化学首都医科大学 - 首都医科大学公共卫生学院.PPT

  1. 1、本文档共10页,可阅读全部内容。
  2. 2、原创力文档(book118)网站文档一经付费(服务费),不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
  3. 3、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。如您付费,意味着您自己接受本站规则且自行承担风险,本站不退款、不进行额外附加服务;查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档,您可以点击 这里二次下载
  4. 4、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“版权申诉”(推荐),也可以打举报电话:400-050-0827(电话支持时间:9:00-18:30)。
查看更多
卫生化学首都医科大学 - 首都医科大学公共卫生学院

毒理学基础 首都医科大学 卫生化学 首都医科大学 卫生毒理学与卫生化学学系 2014.11.7 实习一 荧光分析法测定尿中核黄素(VB2)含量 一、实验目的与要求 1、掌握荧光分析法的基本原理及方法。 2、掌握固相萃取法对样品进行分离纯化的技术。 3、熟悉荧光分光光度计的使用方法。 二、实验原理 核黄素(VB2)在一定波长的光波照射下发荧光。在pH6~7的溶液中荧光最强,在其它条件恒定时,荧光强度F与VB2浓度C成正比,即F=KC;当pH11时荧光消失。尿中共存物质干扰VB2的测定,需将尿液通过硅镁吸附柱,使其中VB2被硅镁吸附剂吸附,再用洗脱液洗脱,测定洗脱液中VB2的荧光强度。采用标准曲线法进行定量。 三、实验仪器及试剂 仪器与器皿: 岛津RF5301型荧光分光光度计,样品池,脱脂棉,吸附柱(内径0.8~1.0cm,柱长8cm),50ml、1000ml容量瓶,10ml比色管,2ml移液管。 试剂:  1)VB2标准贮备液(25mg/L):准确称取25.0mg核黄素,加400ml双蒸水,加冰醋酸1~2ml,加热溶解,冷却后转移至1000ml容量瓶中并用双蒸水稀释定容,摇匀,贮存于棕色试剂瓶中。 2)VB2标准应用液(0.5?g/ml):取标准贮备液1ml于50ml棕色容量瓶中,用0.1mol/LHAc溶液稀释至刻度,摇匀(现用现配)。 3)硅镁吸附剂(60~100目)。 4)洗脱液:按体积比丙酮:冰醋酸:双蒸水=5:2:9。 5)0.1mol/L HAc溶液。 四、实验步骤 1、装柱 用一小团脱脂棉将吸附柱管下端轻轻塞住,将1.5g左右的硅镁吸附剂于适量的蒸馏水混合装柱(约占柱长的2/3左右),用双蒸水测试流速,流速控制在60~80滴/分,柱内应无气泡。 2、标准曲线的绘制 (1)吸附:取VB2标准应用液0.00、0.50、1.00、1.50、2.00和2.50ml,分别过柱,用15~20ml热水(60~70℃)淋洗柱子。 (2)洗脱:将10ml比色管接在柱子下端,每个吸附柱中加入5ml洗脱液,待流尽后再用不足5ml的蒸馏水淋洗柱子,流出液一并盛入比色管中,用双蒸水定容至10ml,混匀,避光保存。 (3)测定 取任一标准溶液的洗脱液,固定荧光波长535nm,在350~500nm的波长范围内,测定不同激发光波长下的荧光强度,以激发光的波长为横坐标,荧光强度为纵坐标,绘制激发光谱,选择激发光波长(?ex)。 固定激发光波长?ex,在450~600nm的波长范围内,测定不同荧光波长下的荧光强度,以荧光的波长为横坐标,荧光强度为纵坐标,绘制荧光光谱,选择荧光光波长(?em)。 在固定?ex和?em的条件下,分别测定不同浓度标准溶液洗脱液中VB2的荧光强度,以VB2的浓度C为横坐标,相对荧光强度?F= F-F0为纵坐标,绘制标准曲线。 3. 测定样品 取尿样5.00ml,通过吸附柱进行吸附、洗脱和荧光测定(方法于上述标准系列相同)。 4.结果处理 根据测定的样品相对荧光强度?Fx= Fx-F0,从标准曲线上查 出样品管对应的VB2浓度,并计算尿中VB2含量。 尿中VB2含量(mg/L)= 样品管中VB2浓度×10/取尿量 【注意事项】 1.操作应在避光条件下进行。 2.测定前应用洗脱液通过硅镁吸附剂柱,检查流出液是否有荧光物质。若有,则用丙酮洗硅镁吸附剂,然后烘干待用。 3.装柱时要与水混装,以免柱内形成气泡和空隙。 【思考题】 1.是否能用荧光计代替荧光分光光度计测定荧光光谱和激发光谱?为什么? 2.使用荧光分光光度计应注意哪些问题? 谢 谢! 毒理学基础 首都医科大学 卫生化学 首都医科大学

文档评论(0)

2105194781 + 关注
实名认证
内容提供者

该用户很懒,什么也没介绍

1亿VIP精品文档

相关文档