菌种活化操作方法.docVIP

低温保存管（cryotube）中之一般菌种临时存放及活化 A. 低温保存管之临时存放及解冻 1. 低温保存管（cryotube）应存放于－20℃ ~ －80℃之低温条件下。 2. 准备 37℃之 70﹪（V/V）酒精浴槽（只能在电气水浴槽中改放酒精，不可以火加温，以免危险；若以 37℃水浴取代，应避免水中微生物污染），其中事先安放小试管架（可放置 cryotube 之大小），液面不可高达管塞。 3. 将 cryotube 从低温保存条件中取出，置于 37℃浴槽之小试管架上。 4. 不断轻微摇动 cryotube，液面不可高至管塞，直至结冰完全溶解（约需 2 分钟）。 B. 菌株活化: 在无菌操作下 1. 用无菌微量吸管，从已溶解之 cryotube 吸取 50 ?l（或 1 ~ 2 滴）之菌液，滴入固态指定培养基(培养基编号及温度示于菌株订购单)某一边缘附近，以划线法接种于培养基。 2. 将接种好的培养基置于指定温度的培养箱中培养。 C. 划线法 1. 手持金属接种环，用酒精灯将接种环（共约 5 公分）烧至火红，并不断来回烧烤金属固定杆之前约 10 公分，等待约 10 秒钟，将接种环前端轻触培养基边缘凝胶（无菌体部份），待接种环完全冷却后，以环沾黏菌滴，由培养基边缘向中央轻轻横划紧接的并行线，直到涵盖 1/3 培养基为止（I 区）。 2. 灼烧接种环，待数秒冷却后，旋转培养基自 I 区涂布的边缘再横划数条线到未接种的区域（II 区）。 3. 重复 2. 的动作完成 III 区与 IV 区。 4. 灼烧接种环，将接种环归位。 D. 图示 （1）金属接种环 （2）平板划线法 冷冻干燥管之开管说明 下列步骤请在无菌环境下操作： 1、以沾有70%酒精的棉花，擦拭外管，在火焰上加热外管之尖端。 2、滴数滴无菌水于加热处，使外管破裂，再以硬棒敲破尖端。 3、取出隔热纤维纸和内管，以灭菌过的镊子取出内管之棉塞。 4、( a ) 适用于细菌用无菌吸管，吸取0.3-0.5 ml指定之液体培养基，滴入内管内，并轻微震荡（可用该吸管协助），直到均匀悬浮。( b ) 适用于霉菌、酵母菌用无菌吸管，吸取0.3-0.5 ml无菌水，滴入内管内，待干燥粉末溶解后，以无菌吸管吸取并滴入约含有5ml无菌水之试管内，轻微震荡使其均匀后，静置30至60分钟。 5、取0.1-0.2 ml之菌体悬浮液于指定的平板培养基上，做划线分离培养或做成一系列之稀释，用无菌L型玻棒均匀涂抹，以检验菌种之纯度及活化情形，而剩余的菌体则全部移入指定的液体培养基内，并依指定的温度培养之。 6、某些菌种经过冷冻干燥保存后，迟滞期 ( lag period ) 较长，必须等培养二倍时间后才能长出，且再经过一、二次继代培养 (Subculture) 后才能正常生长。经过以上的努力后仍培养失败，才视为不能活化。 7、若菌种未能活化，或活化之菌落有疑问时，请于收到菌种之一个月内，以问题菌株反应单传真至本中心，即进行处理。 8．未开封之冷冻干燥管，请冷藏于4℃冰箱，切勿冷冻保存。 双歧杆菌的活化 请问各位双歧杆菌的冻干粉怎么活化？ 活化培养基是什么？ 活化时间？ 活化时需要特别注意什么？ 谢谢！ -------------------------------------------------------------------------------- 脱脂乳7份+豆奶3份混均，加2%的酵母浸出液，2%的酪蛋白胨，0.1%的抗坏血酸，葡萄糖2%，混溶分装试管，利用间歇灭菌法(同上)灭菌，冷却，低温保存，备用。双歧杆菌为厌氧菌，需进行厌氧培养。在无氧条件下，打开干燥菌种菌管，用接菌环取冻干菌种于双歧杆菌活化培养基内，38℃恒温厌氧培养24ｈ，取深层活化菌种传入下一代培养基中深层培养，反复活化传至第5代，每代均为38℃及24ｈ。 -------------------------------------------------------------------------------- 一般传两代以后，才能正常使用！ 常用活化培养基　　　液体培养基 有PYG　　固体有TPY 活化方法，　ATCC推荐：1、冻干粉菌开封以后，用生理盐水，溶解！接种于液体培养基上！培养为正常生长时间的二倍，36±1℃ 2、然后将其离心集菌，接种于平板上，养为正常生长时间的二倍，36±1℃ 　　　　　　自我感觉，液体培养基活化不好用！我的活化方法：冻干粉菌开封以后，用小牛血清溶解！接种于TPY固体培养基上！培养为72H，36±1℃ ，然后挑菌，接种于平板上，培养为72H，36±1℃ 即可