相差显微镜.docxVIP

相差显微镜一、实验目的掌握相差显微镜的原理，构造及其使用方法。二、器材与试剂普通复式显微镜，相差显微镜附件：相差物镜、转盘聚光器、调中合轴望远镜和绿色滤色镜、载片、盖片、滤纸、活体生物样品等。三、实验原理在显微镜下镜检时，视场中的样品只有在反射光的波长（颜色）和振幅（亮度）与周围介质有变化时，方能窥见被检样品。活的样品多为无色透明，照明光线通过这种物体时，透过或反射光的波长和振幅都不发生改变，所以用普通光学显微镜难以辨清活体的结构。必须借助于固定和染色等理化方法，使样品和背景的反射或透射光在波长和振幅上发生变化，即在颜色和亮度上有所差异，以供识别。相差方法应用于生物学上的主要价值，在于它能对透明的活体进行直接观察，无需采用使细胞致死的固定和染色的方法。染色合活体以有害的影响，甚至失真。由此，才使相差法显得异常重要。1．相差相差是指同一光线经过折身率不同的介质其相位发生变化产生的差异。相位是指在某一时间上，光的波动所达到的位置。一般由于被检物体（如不染色的细胞）所能产生的相差的差别太小，我们的眼睛是很难分辨出这种差别的。只有在变相差为振幅差（明暗之差）之后，才能被分辨。当光波通过两种折射率不同的物质时，如空气→水，或由空气→玻璃，其波长、振幅和相位皆有不同的变化。例如：光波分别通过1cm厚的水和1cm厚的玻璃时，由于两者折射率不同，通过它们的光波在相位上产生一定的差异。通过玻璃的光波相位落后，因为玻璃的密度和折射率比水大。所以，光波的波长和频率都小于水。相差决定于光波所通过介质的折射率之差及其厚度，等于折射率与厚度的乘积之差（即光程之差），介质越厚或折射率越大，光波减速也越大。相差显微镜就是利用被检物的光程之差进行镜检的。2．衍射与干涉用肉眼看不到的相差，只要利用衍射和干涉现象，把相差变为明暗的振幅差，就可能看到。（1）衍射波在同一均匀媒质里传播是沿直线方向进行的，如果在它传播的方向上，遇到迎面挡住的孔或障碍物不比它的波长大得多，这时波就会明显的绕到障碍物后面或孔的外面去（传播路线发生了弯曲），这种现象叫波的衍射。光也有衍射。光通过大小同光的波长的相差不大的细小物体时，也要发生衍射。（2）干涉在同一种媒质里传播的两列波，如果它们的频率和波长相同，在两列波相交的区域里，由于叠加的结果，每一点的合振幅都是一定的，并且出现振动加强和振动减弱，这就是波的干涉。光也发生干涉。光波通过小颗粒的物体后产生直射光（S）和衍射光（D），衍射光的光波振幅小，相位滞后。在光学系统中，这种直射光和衍射光相遇或光的叠加，振幅发生变化，光线或明或暗，就是光的干涉现象。如果物体粒子是折射率稍大于周围媒质的极小的透明体时，由于光程（折射率和厚度的乘积）比较大，所以通过粒子的光比周围的光在相位上有所推迟。这是因为被检粒子的衍射光相位比直射光相位大约迟1/4波长的缘故。若是在直射光的通过点和大部分的衍射光的通过面放置吸收光的物质或推迟相位的物质时，就能分别改变直射光和衍射光的相位和振幅。如果把直射光相位推迟1/4波长，使之与衍射光保持同一相位，合成波（P）等于直射光与衍射光振幅之和，即P=S+D，振幅加大，亮度提高。相反地，把衍射光相位推迟1/4波长，两者的相差变成1/2波长，合成波的振幅等于两波的振幅差，即P=S-D，这时亮度要减弱、变暗。光线的相位肉眼是看不到的，但是利用衍射和干涉的现象把相位差变成振幅差（明暗反差）就能用肉眼识别。图1-2表示直射光（S细线）和衍射光（D虚线）干涉的现象。D的相位比S被推迟1/4波长。合成波（P粗线）由S与D两者干涉而生成，形成被检物体的像，振幅与S相同，相位稍推迟。图1-2 直射光和衍射光的干涉S：细线，直射光； D：虚线，衍射光；P：粗线，合成波。3．相板的作用为了达到相差效应，在相差显微镜的物镜中，装有由光学玻璃制成的相板（phase plate）。在圆形相的平面上，有一圈与周围（里外）相板厚度不同的或凸凹的圆环。其结构如图1-3。相板分两部分：（1）共轭面（conjugate area）：通常为环状，是通过直射光的部分。其环是凸起的，也可能是凹陷的。（2）补偿面（complemetary area）：共轭面内外两侧部分，是通过衍射光的部分。在相板的共轭面或补偿面上，涂有改变光波相位或吸收光线的物质。当光线通过时，使光波的相位或振幅改变，从而达到不同的目的与观察效果。利用相板把光波相位推迟，振幅改变。相板的作用，除推迟直射光和衍射光的相位之外，还有吸收光，从而使亮度改变的作用。物镜的后焦点位于透镜中间而相板位于物镜的后焦面上，所以，相板也安装在透镜中间。图1-3 相板的种类及构造左上：吸收直射光的明反差相板平面和剖面图；左下：吸收直射光的喑反差相板剖面图；右上：吸收衍射光的明反差相板平面和剖面图；右下：吸收衍射光的暗