zj基因工程第5章(目的基因的合成完全版).ppt

基因工程主要是通过人工的方法分离、改造、扩增并表达生物的特定基因，从而深入开展核酸遗传研究或者获取有价值的基因产物。通常将那些已被或者准备要被分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA片段，称为目的基因。因目的基因片段需插入载体，导入宿主细胞内复制，所以对宿主细胞DNA而言，又称它为外源性基因。 目的基因用途 ①研究该基因的全貌与内涵，如详细分析其结构、功能及调控。 ②与正常基因对比，寻找异常基因的异常点，进而探索疾病发生的分子生物学机理及治疗对策。 ③研究生物种系进化与相关同源性。 ④应用某种基因大量表达，生产所需要的蛋白质或多肽（如胰岛素、干扰素等药物）。 ⑤在农、林、牧、副、渔业中，改造某些目的基因，以改良品种，促进经济发展。 ⑥建立基因治疗院，选用某种正常基因，引入患者体内，对某些先天性遗传疾病进行治疗。 第一节 基因组文库的构建 某种生物的基因组的全部遗传信息通过克隆载体贮存在一个受体菌的群体之中，这个群体即为这种生物的基因组文库。若这个群体中只贮存某种生物基因组的部分遗传信息，则称为部分基因组文库。 1.1 基因组文库构建的基本步骤 ①细胞染色体大分子DNA的提取和大片段的制备； ②载体DNA的制备； ③载体与外源大片段的连接； ④体外包装及基因组DNA文库的扩增； ⑤重组DNA的筛选和鉴定。 1.2 基因组DNA的切割（制备） 用于基因组文库构建的DNA片段的切割一般采用超声波处理和限制性内切酶部分酶切两种方法，其目的是： 第一，保证DNA片段之间存在部分重叠区 第二，保证DNA片段大小均一 超声波处理后的DNA片段呈平头末端，需加装人工接头 部分酶切法一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶，如：Sau3AI或MboI等，这样DNA酶解片段的大小可控 连接前，上述处理的DNA片段必须根据载体的装载量进行分级分离，以杜绝不相干的DNA片段随机连为一体。 1.3 载体和受体的选择 出于压缩重组克隆的数量，用于基因组文库构建的载体通常选装载量较大的λ-DNA或考斯质粒；对于大型基因组（如动植物和人类）需使用YAC或BAC载体 由于绝大多数真核生物的mRNA小于10 kb，因此用于cDNA文库构建的载体通常选质粒 上述几种载体的最大装载量如下： 质粒 15 kb λ-DNA 25 kb 考斯质粒 45 kb BAC 300 kb YAC 400 kb 用于基因文库构建的受体则根据载体使用大肠杆菌或酵母菌 1.4 重组DNA分子的构建 一般选择10uL的连接反应体系，其中DNA片段与载体臂之间的摩尔数比为2：1 1.5 重组DNA分子导入受体细胞 一般采用噬菌体颗粒的形式将重组DNA分子导入大肠杆菌细胞中，以提高建立基因文库的效率。 1.6 基因文库的完备性 基因文库的完备性是指：在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示： N = ln ( 1 – P ) / ln ( 1 – f ) 其中： N：重组子的数量 P ： 任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率 f ： 克隆片段的平均大小/ 生物基因组的大小 例如，人的单倍体DNA总长为2.9 x 109 bp，基因文库中克隆片段的平均大小为15 kb，则构建一个完备性为0.9的基因文库至少需要45万个克隆；而当完备性提高到0.9999时，基因文库至少需要180万个克隆 1.7 基因文库的质量标准 除了尽可能高的完备性外，一个理想的基因文库应具备下列条件： 重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力 载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆 克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利克隆排序 克隆片段易于从载体分子上完整卸下 重组克隆能稳定保存、扩增、筛选 1.8 基因文库的扩增、分装及保存 液体培养增殖法； 影印滤膜培养法； 制备转导性裂解物； 第二节 cDNA基因文库构建 2.1 cDNA基因文库构建的步骤 细胞总RNA的制备及mRNA的分离 cDNA第一条链的合成 双链cDNA的合成 cDNA与载体的连接 噬菌体颗粒的包装 转染或质粒的转化 cDNA第一链的合成 cDNA第二链的合成 自身引导法：获得的双链cDNA 5’端会有几对碱基缺失 cDNA第二链的合成 置换合成法：获得的双链cDNA 5’端也会有几对碱基缺失 cDNA第二链的合成 引导合成法：获得的