hRNA慢病毒质粒的构建技巧.PDFVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１１，３１（３）：１２４１２７ ? 檪檪檪檪檪檪檪檪殏 檪 殏 檪 檪 读者来信 殏 檪 殏檪檪檪檪檪檪檪檪 ｓｈＲＮＡ慢病毒质粒的构建技巧 １，２ １，２ ２ ３ ３ 秦俊文 　谢琪璇 　蔡冬青 　秋山泰身 　井上纯一郎 （１暨南大学生殖免疫研究所　广州　５１０６３２　２暨南大学再生医学教育部重点实验室 再生医学香港中文大学 暨南大学联合实验室 科技部及广东省科技厅国际科技合作基地　广州　５１０６３２） （３东京大学医科学研究所分子发癌分野　东京　１０８８６３９） 　　携带ｓｈＲＮＡ慢病毒质粒的慢病毒宿主范围广，能感染分裂期与非分裂期细胞，转染效率高，ｓｈＲＮＡ在宿主细 胞中能高效、长期稳定地表达，因此ｓｈＲＮＡ慢病毒载体正被越来越广泛地应用于ＲＮＡｉ研究和疾病治疗中。然而， ｓｈＲＮＡ慢病毒质粒设计的合理性直接影响ＲＮＡｉ的效果。构建ｓｈＲＮＡ慢病毒质粒时综合利用多种设计和构建技 巧，包括合理选择与靶基因同源的特异性核苷酸序列并作适当改变，以及选择合适的ｌｏｏｐ核苷酸序列等都将大大 提高ｓｈＲＮＡ抑制靶基因表达的效果。这些方法对ｓｈＲＮＡ的设计和ｓｈＲＮＡ慢病毒质粒的构建具有重要的参考和 指导意义。 　　ＲＮＡ干扰（ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，ＲＮＡｉ）是利用序列特异性的、与靶基因同源的双链 ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅｓｔｒａｎｄＲＮＡ， ［１］ ｄｓＲＮＡ）对靶基因转录后的ｍＲＮＡ的分解，从而抑制靶基因表达的一种转录后基因沉默现象 。ＲＮＡｉ现象最初是 ［２］ 由Ｆｉｒｅ等 研究线虫时发现的；此后，ＲＮＡｉ的研究取得了突飞猛进的发展。由于ＲＮＡｉ抑制靶基因表达具有特异 性强、快速、高效等优点，现已被广泛应用于基因功能分析、细胞内信号转导通路研究，以及抗肿瘤、抗病毒和基因 ［３７］ 治疗中 。最初的ＲＮＡｉ实验采用体外合成小干扰ＲＮＡ（ｓｍａｌｌｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅＲＮＡ，ｓｉＲＮＡ））的方法，但存在费用昂 贵、转移到细胞内的ｓｉＲＮＡ半衰期短、其本身不能持久性表达、对靶基因表达的抑制作用短暂等缺点，从而使其应 用受到较大的限制。而将小发卡状ＲＮＡ（ｓｍａｌｌｈａｉｒｐｉｎＲＮＡ，ｓｈＲＮＡ）载体导入细胞后，能在细胞内稳定地转录生 成ｓｈＲＮＡ，并进一步加工生成靶基因特异性ｓｉＲＮＡ，因此可以发挥长期抑制靶基因表达的作用。 　　普通的ｓｈＲＮＡ非病毒性载体虽可转染到周期性分裂期细胞中，但几乎无法将其转染到非分裂期细胞、原代细 胞、未分化细胞以及人和动物个体中去。而利用病毒包括腺病毒（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、逆转录病毒（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）和慢病毒 （ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）等来转染ｓｈＲＮＡ病毒性载体，因其转染效率高、操作简便以及ｓｈＲＮＡ在宿主细胞中能高效、稳定地表 达等优势已被广泛用于ＲＮＡｉ的研究和治疗中。特别是携带ｓｈＲＮＡ载体的慢病毒，有着广泛的宿主范围，能感染 ［６］ 分裂期与非分裂期细胞 ，并能将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达ｓｈＲＮＡ的目的；而 且产生的ｓｈＲＮＡ靶向性好，可有效抑制靶基因表达。此外，产生的慢病毒可进一步浓缩，从而大大提高其转染效 ［８］ ［９］ 率 。与腺病毒和逆转录病毒相比，慢病毒本身对宿主几乎不产生免疫原性，因而具有更高的安全性 。基于上 ［１０］ 述特点，表达ｓｈＲＮＡ的慢病毒载体除可广泛应用于周期性和非周期 性细胞、干细胞等的基因功能