亚胺培南、头孢吡肟、头孢曲松和氨曲南对阴沟肠杆菌ampc酶的诱导性研究.pdfVIP

实验材料与方法 实验材料 一、菌株来源 实验所用菌株为我院呼吸病房(包括RICU)2000年6月一 20E 2002年6月分离的25株阴沟肠杆菌，所有实验菌株均以API 系统进行鉴定。标准菌株E．cloacae029M、029、1194E由北京协 和医院细菌室惠赠。 二、实验试剂 (FEP)、头孢西丁(FOX)、克拉维酸干粉、头孢唑林、青霉素、氯唑 西林。M—H琼脂，两性电解质载体(PH3．5—10，)，考马斯亮兰 (G250)，碘，碘化钾，丙烯酰胺和N，N’一亚甲双丙烯酰胺，Taq 酶、Taq酶缓冲液和dNTPs，琼脂糖和溴化乙啶。 三、实验仪器 电热恒温培养箱，低温高速离心机(rosA)，752紫外可见分光 光度计，水平电泳仪，LKB2117等电聚焦系统，DNA扩增仪。 实验方法 一、标本来源 院的下呼吸道感染患者的合格痰标本及防污染毛刷刷取的气管内 分泌物标本。 二、药敏实验 采用纸片扩散法及E—test试条进行药物敏感性及MIC值检 测，按1999年美国临床实验室标准委员会NCCLS操作规则进行。 三、头孢西丁诱导实验 分别对第三代头孢菌素敏感(包括中介)或耐药的菌株进行 头孢西丁诱导实验。通过测定诱导前后的酶活性以筛选出野生 ．2． 型、高诱导型和去阻遏型菌株。 四、阴沟肠杆菌AmpC酶的诱导性实验 对头孢西丁筛选出的野生型和高诱导型菌株各5株(包括2株标 准菌株E．cloacae029和E．cloacael 194E)进行AmpC酶诱导性实 验。 五、13一内酰胺酶的提取 六、AmpC酶等电点测定及抑制实验 用LKB2117等电聚焦系统测定B一内酰胺酶的等电点。电 抑制实验。 七、AmpC酶活性测定 用紫外分光光度计分别测定加入酶提液前后头孢唑啉在 化，最后计算其平均每分钟吸光度降低值。 八、三维试验及突变率测定 根据三维试验阳性的细菌株数，计算抗生素筛选后高诱导菌 株的突变率。突变率=0．69木(mt—m0)／(nt—nO) 九、模板DNA的制备 十、ampD基因的PCR扩增 十一、ampD基因的测序和序列分析 十二、统计学分析：应用方差分析法和x2检验。 实验结果 一、头孢西丁诱导实验筛选结果 临床分离到的25株阴沟肠杆菌中，对第三代头孢菌素CRO、 度耐药的有9株菌。经头孢西丁诱导实验筛选，野生型菌株12株 ’ ·3· (均为敏感菌株)，高诱导菌株为4株(其中2株为敏感菌，2株为 中介)，去阻遏菌株为8株(均为耐药菌)。 二、抗菌活性测定 选取5株野生型菌株和5株高诱导菌株作为实验菌株(包括 验前后ATM、CRO、FEP、IPM对菌株的体外抗茵活性。结果表明， 这四种抗生素对野生型菌株诱导前后的MIC值变化不明显，而对 高诱导菌株的MIC值变化较大，以氨曲南和头孢曲松诱导后的 MIC值增高最为明显，可达10．7—128倍，表现为高度耐药。而 IPM和FEP对高诱导型菌株无论是诱导前后始终都很敏感。 三、B一内酰胺酶等电点测定及抑制实验结果 等电聚焦电泳结果显示，高诱导型菌经诱导实验后筛选出的 菌株均分别只含有1条pI在8．0—8．9之间、不被克拉维酸抑制 但可被氯唑西林抑制的酶带，故提示为染色体头孢菌素酶。 四、不同B一内酰胺抗生素对高诱导型阴沟肠杆菌AmpC酶 诱导活性的比较。 临床常用的B一内酰胺抗生素对野生型阴沟肠杆菌几乎无诱 导性，而对高诱导型阴沟肠杆菌有一定的诱导作用，其中以亚胺培 南对AmpC酶诱导作用最为突出，与其他三种抗生素相比有统计 学差异。同一种B一内酰胺抗生素对AmpC酶的诱导作用与其浓 度有一定的相关性，以2MIC诱导作用最强，氨曲南和头孢曲松最 为明显。头孢吡肟诱导产AmpC酶活性相对较低，而且其诱导作 用与浓度的相关性不明显。 五、高诱导