硼替佐米单用或联合三尖杉酯碱体外诱导HL60细胞凋亡实验研究论文.docVIP

　　硼替佐米单用或联合三尖杉酯碱体外诱导HL60细胞凋亡实验研究论文 孙启鑫，孟凡义，扶云碧，李利 【摘要】 本研究探讨硼替佐米（bortezomib， Bor）单用或联合三尖杉酯碱（harringtonine， HT）对HL60细胞凋亡的影响。以不同浓度Bor、HT处理HL60细胞12-48小时，采用MTT比色法检测细胞增殖活性，以DNA凝胶电泳、荧光显微镜检、流式细胞术检测细胞凋亡。结果表明： 10-50 nmol/L Bor可有效抑制HL60细胞增殖.freelol/L剂量处理12小时即有细胞凋亡发生，延长作用时间或增加药物剂量可使细胞凋亡率明显增加。30 nmol/L HT与10 nmol/L Bor联合应用时，可见HL60细胞凋亡率比两种药物单独使用时显著增加。结论： Bor对HL60细胞具有时间和剂量依赖性的细胞凋亡诱导效应，与HT联合应用有明显的协同作用。 【关键词】 硼替佐米； 三尖杉酯碱； 凋亡 Induction of Apoptosis in HL60 Cells by Bortezomib alone or in bination of this study ib alone and in bination ib, harringtonine in different concentrations for 12-48 hours. Cell proliferation icroscopy and floetry. The results shool/L bortezomib could effectively inhibit HL60 cell proliferation, and induced its apoptosis. After treating for 12 hours, 10 nmol/L bortezomib could trigger cells apoptosis. I 1640培养液为Gibco公司产品，新生牛血清为杭州四季青公司产品，MTT、Hoechst33342、碘化丙锭（PI）、RNA酶A、蛋白酶K均为Sigma公司产品。硼替佐米（bortezomib、Velcade、万珂）为美国Millennium公司产品（西安杨森制药有限公司惠赠），用无菌水配成1 mg/ml浓度备用。三尖杉酯碱注射液为北京协和制药厂产品，使用时稀释到实验所需的浓度。 细胞培养 HL60白血病细胞株购自天津血液病研究所，用含10%小牛血清RPMI 1640培养液，在37℃、5% CO2条件下培养，1-2天换液1次，取对数生长期细胞用于实验。 中国实验血液学杂志 J Exp Hematol 2007; 15(2)硼替佐米或联合三尖杉酯碱诱导HL60细胞凋亡实验研究研究方案 依预试验结果，选择Bor（10-50 nmol/L）和HT（7.5-75 nmol/L）分别单独处理HL60细胞12-48小时，观察药物剂量反应效应。根据药物反应结果，选择HT IC50剂量与Bor各浓度联合，观察药物联合后对HL60细胞的协同效应。 细胞增殖活性MTT检测 对数生长期细胞调整密度为1×105 cells/ml，每孔100 μl接种，按要求加入不同浓度处理药物，终体积200 μl/g/ml），继续孵育4小时。离心并吸弃上清，加DMSO 170 μl/ OD值（A）。细胞活力计算: 细胞活力（%）=（A处理组－A调零组/A对照组－A调零组）×100% 细胞形态学观察 Hoechst33342以终浓度10 μg/ml加入培养板各处理组细胞中，避光染色15分钟，倒置荧光显微镜下观察细胞形态变化。 DNA提取及电泳 参照文献［2］,分别收集各浓度药物处理的细胞5×105个，用PBS洗涤1次，加入20 μl裂解缓冲液［EDTA 20 mmol/L, Tris 100 mmol/L, pH 8.0, 0.8%(g/ml）, 37℃水浴60分钟。再加入10 μl蛋白酶K（20 mg/ml）,.freell PI(100 μg/ml)和RNA酶A（100 μg/ml）染液，于4℃避光染色30分钟，400目筛网过滤后，流式细胞仪检测。 统计学分析 所有实验至少重复3次，应用SPSS 10.0软件进行数据分析，均数比较采用t检验，设定P＜0.05为显著性差异。 结 果 HL60细胞增殖活性 10-50 nmol/L Bor 对HL60细胞的增殖均有一定抑制作用，表现为时间剂量依赖关系，随浓度增加和时间延长抑制效果逐渐增强（图1），其24小时的IC50为20 nmol/L。30 nmol/L剂量处理12-48小时，细胞抑制率与对照组相比差别均有显著性意义（P 0.01）；