碱基序列标记法结合焦磷酸测序测定不同来源基因表达量论文.docVIP

　　碱基序列标记法结合焦磷酸测序测定不同来源基因表达量论文 张晓丹 武海萍 陈之遥 周国华 【摘要】 建立了一种将序列标记反转录聚合酶链反应(PCR)与焦磷酸测序技术结合的相对基因表达量测定法(简称“SRPP”)。先用来源特异性引物对不同来源的同一基因通过反转录标记上特异性标签，PCR后用焦磷酸测序法对扩增产物进行序列解码，使得测序结果中的序列代表基因的来源，峰高代表基因在不同来源中的相对表达量。用实时荧光定量PCR法对本方法的准确性进行了验证，结果表明，SRPP可以同时准确测定同一基因在3个不同来源中的表达量，并实际测定了Egr1基因在糖尿病、肥胖和正常小鼠肝中的表达量差异。 【关键词】 序列标记反转录, 聚合物链反应，焦磷酸测序.freelan公司);Gene SpeⅢ微量核酸蛋白测定仪(日本Naka Instrument公司);PTC225 PCR扩增仪、Opticon实时荧光PCR仪(美国MJ Research公司)。焦磷酸测序装置由本实验室自行组装9,10。此装置主要由焦磷酸测序反应模块、荧光信号放大和数据采集3部分组成。反应模块由位于中间的反应池通过毛细管与四周的dNTP储液池相连组成。通过注射器施压使4种dNTP循环加入反应池完成测序反应。荧光信号通过R6335光电倍增管(日本Hamamatsu Photonics K.K.公司)放大后，经BPCL微弱发光测量仪(北京中国科学院生物物理研究所)采集数据。 Hotstar Taq DNA聚合酶、Omniscript RT kit反转录试剂盒(德国Qiagen公司);Trizol(上海Inviotrogen公司);荧光素、荧光素酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、三磷酸腺苷双磷酸酶和5′磷酸化硫酸腺苷(美国Sigma公司); DynabeadsM280链霉亲和素磁珠(挪威Dynal AS公司); Klenoega公司);所有引物均由上海Invitrogen公司合成。 实验中用到的糖尿病、肥胖和正常小鼠的肝组织由南京师范大学生命科学学院提供。 2.2 RNA的提取 用Trizol试剂盒抽提RNA，用紫外分光光度法测定RNA浓度及纯度。 2.3 反转录合成cDNA第一链 取等量的不同来源的总RNA，分别以来源特异性反转录引物反转录。即取总RNA 0.05～2.0 μg至Nucleasefree的小管中，加DEPCH2O至12 μL;65 ℃反应5 min后，置冰上至少1 min;在上述各小管中加入10×第一链合成缓冲液2 μL，0.5 mmol/L dNTP混合物，10 U RNase 抑制剂，200 U Omniscript Reverse Transcriptase，1 μmol/L反转录引物，加DEPCH2O至总体积为20 μL。反转录条件为：37 ℃ 反应1 h, 93 ℃反应5 min，然后中止反应。 2.4 基因特异性PCR 不同来源的cDNA等比例混合，以共用引物CP(5′CCA TCT GTT CCC TCC CTG TC3′)和生物素标记的基因特异性引物(GSP)进行扩增反应。PCR体系为： cDNA等比例混合液1 μL， 0.3 μmol/L CP和GSP，1.5 mmol/L Mg2+， 0.2 mmol/L dNTP 混合物，10×PCR 缓冲液 5 μL，5×Q 溶液 10 μL ， 1 U HotStar Taq DNA聚合酶，并加入灭菌蒸馏水至50 μL。PCR反应程序为： 94 ℃ 变性 15 min，热循环35次(94 ℃, 40 s; 60 ℃, 40 s; 72 ℃, 1 min )， 72 ℃延伸10 min， 4 ℃保存。基因特异性引物的序列见表1。表1 实验用引物 2.5 焦磷酸测序固相单链模板的制备 取5 μL戴诺磁珠(Dynabeads)，用磁铁吸弃上清液。磁珠以100 μL B g(Ac)2，0.1% BSA，1 mmol/L 二硫苏糖醇(DTT)，3 μmol/L 5′磷酸化硫酸腺苷(adenosine5′phosphosulfate，APS)，0.4 μg/L PVP，0.4 mmol/L D虫荧光素，2×10-4 U/L三磷酸腺苷硫酸化酶，2×10-3 U/L 三磷酸腺苷双磷酸酶，18×10-3 U/L无外切酶活性的Klenog/L荧光素酶。 3 结果与讨论 3.1 方法原理 焦测序技术是一种基于化学发光反应定量测定引物延伸副产物焦磷酸盐(PPi)的测序技术。其原理是：引物与模板DNA退火后, 在DNA 聚合酶(polymerase)、三磷酸腺苷硫酸化酶(ATP sulfurylase)、荧光素酶(luciferase) 和三磷酸腺苷双磷酸酶(apyrase)的协同作用下完