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　　细胞分裂素检测方法的研究进展论文 【摘要】 细胞分裂素是一类重要的植物生长调节激素，对这类激素进行超微定量检测对于揭示其在植物体内的信号转导机理、发挥其对作物生长的调控作用具有重要意义。本文综述了近年来细胞分裂素各种分析方法的研究进展，包括免疫分析法、气相色谱法、高效液相色谱法、毛细管电泳法和电化学方法等，介绍了实际样品常用的前处理方法，并讨论了未来的研究发展方向。 【关键词】 细胞分裂素，免疫分析法，色谱法，毛细管电泳法.freelol/g)，因此，需要高灵敏度的定量分析方法和高选择性的纯化富集样品前处理方法对其进行分析。本文将从这两方面进行论述。 2 分析方法 2.1 免疫分析方法 免疫分析方法具有高效液相色谱法(HPLC)等仪器分析方法所不及的优势及特点：(1) 由于免疫反应的特异性，可用粗提产品直接检测，从而显著提高了测试速度;(2) 免疫分析对特殊仪器的需求较少，分析成本较低;(3) 免疫分析方法的灵敏度高。由于这些优点，免疫分析方法一直在CTKs检测中广泛应用10～21。异戊烯基腺苷(iPR)和反式玉米素核苷(tZR)作为免疫分析研究中的半抗原，所制得的抗体对N6上的取代基有较好的识别，即对于与半抗原R1不同的分子交叉反应较小。 最早用于CTKs测定的免疫分析方法是放射性标记的免疫分析法(RIA)10～13，分别实现了对iPR类10和ZR类11CTKs的定量检测。其中aldiney等15将生物素亲和素体系引入ZR的酶联免疫吸附分析(ELISA)方法，使得检出限可以达到3～5 pg，线性范围在1～1000 pg，利用这种技术可以检测100 mg西红柿样品中的ZR含量。Zhao等16提出了一种简化的间接竞争ELISA法，将抗体、竞争分子和酶标二抗在同一步中加入，可以缩短检测时间，同时在一定程度上提高了灵敏度(对ZR为1.3倍)，但该方法的试剂消耗量更大。 由于CTKs都是小分子，因此在制备抗体时需先将CTKs与载体蛋白(如牛血清白蛋白(BSA)，鸡卵白蛋白(OVA)等)偶联制得全抗原。文献10～20中所采用的偶联方法都是Erlanger等22建立的核苷类分子与蛋白分子上的自由氨基共价偶联的方法(如图1所示)。Papet等21研究了iPR与蛋白的另一种偶联方法。ELISA和RIA的检测结果表明，这种偶联方法制得的多克隆抗体对iPR和iP具有专一性，与Z和ZR没有交叉反应。进一步使用这种抗体制得免疫亲和吸附胶，对iPR的吸附容量达到1 mg/L。 图1 嘌呤核苷与蛋白的偶联方法22 Fig.1 Conjunction of adenosine to protein222.2 气相色谱法(GC) 由于CTKs分子挥发性较弱，无法直接用气相色谱(GC)方法来分离检测，所以对CTKs进行GC分离检测都需要先经过衍生化23～29。Most 等23首次报道了三甲基硅烷(TMS)衍生物用于CTKs的GC分离检测。分别制备了iP、玉米素、二氢玉米素、激动素及其相应核苷的衍生物。制备方法为：将iP等化合物与双(三甲基硅烷)乙酰胺(BTMSA)在60 ℃的乙腈溶液中反应5 min。衍生前样品需要经过严格的干燥。虽然这种衍生方法比较简便，但由于在实际操作中难以控制N6上的取代反应，影响了测定结果的重现性。 全甲基化衍生技术由Morris24和Young25在1977年建立，首先用强碱对CTKs分子进行处理，处理后的产物再与碘甲烷反应。虽然这种衍生方法在操作上比TMS法要复杂，但它具有以下优点：(1) 全甲基化衍生物更稳定，从而可以进一步用HPLC或其它方法纯化;(2) 形成的衍生物单一;(3) 甲基化后分子量只增加14，而TMS法增加72，分子量的大增使当时的质谱检测方法受到限制。Morris等24通过对全甲基化衍生物的质谱图进行分析，从长春花的组织中首次检出了天然的ZOG和ZROG。Young25对比了一系列强碱的衍生化效果发现，二甲亚砜碳负离子有很好的效果(二甲亚砜碳负离子由特丁基锂加入二甲亚砜中制得)。 Ludean等27比较了使用乙酸酐在不同溶剂、温度、反应时间等条件下对CTKs类分子的乙基化结果，找到了一种简单、回收率高、副产物少的衍生化反应条件，使用GCMS对衍生化CTKs的定量检测可以达到pmol级的检出限。这种方法的缺点是：R3为葡萄糖基的CTKs衍生化产物，在GCMS系统中不稳定;玉米素类和二氢玉米素类CTKs的衍生物在EIMS谱图中的分子离子峰很弱。因此，该方法不适于这两类CTKs中新型分子的鉴定。 Birkemeyer等28使用N甲基N(特丁基二甲基硅烷基)三氟乙酰胺(MTBSTFA)对tZ、mT以及吲哚乙酸(IAA)、茉莉酸(JA)、水杨酸(SA)和脱落酸(ABA)等植物激素同时