细胞膜表达的HLAG诱导免疫耐受性树突状细胞的产生论文.docVIP

　　细胞膜表达的HLAG诱导免疫耐受性树突状细胞的产生论文 周浩 黎纬明 张敏 刘峥嵘 邹萍 【摘要】 为了探讨体外诱导免疫耐受性树突状细胞(dendritic cell, DC)产生的方法及其机制，利用人HLAG1真核表达载体转染K562细胞并与DC共培养后，用流式细胞术检测DC表面CD80、CD86、ILT3和ILT4分子表达情况，同时采用氚胸腺嘧啶核苷（3HTdR）掺入法检测DC对T细胞功能的影响。结果表明，膜表达的HLAG1分子与树突状细胞作用后，DC表面免疫共刺激分子CD80、CD86表达下调，而抑制性分子ILT3、ILT4表达上调。HLAG1作用后DC异基因抗原诱导淋巴细胞增殖的活性明显下降。结论：HLAG1分子可以在体外条件下，下调DC表面免疫共刺激分子水平.freelbraneBound HLAG Abstract In order to study hoechanism, the K562 cells transduced munological changes, such as membrane molecules CD80, CD86, ILT3 and ILT4 expression levels etry. Allogeneic proliferation of peripheral blood mononuclear cells (PBMNC) ixed lymphocyte reaction. The results shoulate the allogenic PBMNC. It is concluded that the membranebound HLAG can upregulate expression of inhibitory receptors ILT3 and ILT4, inducing tolerogenic DC in vitro, ay provide a novel strategy for transplant tolerance induction. Key phocyte; immune tolerance 移植排斥所导致的移植物抗宿主病（GVHD）是骨髓移植领域的难题。目前临床免疫抑制剂的应用虽然可以显著降低急性GVHD的发生，但是慢性GVHD损害的发生仍然难以克服。诱导受者外周免疫耐受被认为可能成为解决移植后慢性GVHD的有效途径［1］。树突状细胞（dendritic cell，DC）是体内功能最强的专业性抗原呈递细胞，是活化初始CD4+T细胞最有效的抗原呈递细胞。近年来，人们逐渐认识到DC在外周免疫耐受中的作用，并寻找诱导免疫耐受性树突状细胞产生的有效途径［2］。免疫耐受性树突状细胞膜上高表达ILT3和ILT4分子，它们的可能配体是HLAG［3］。研究发现，HLAG促进心脏移植后的外周免疫耐受状态的产生，其机制可能与诱导树突状细胞耐受有关［4］。本实验希望通过对HLAG诱导DC免疫耐受的机制的研究，探讨诱导免疫耐受性DC产生的新的有效方法。 材料和方法 主要试剂、细胞株及HLAG1 真核表达质粒 RPMI 1640培养液、DMEM培养液、G418、TRIZOL一步法提取RNA试剂及逆转录试剂盒均购于Gibco公司，Lipofectamine 2000脂质体转染试剂盒购于Invitrogen公司，小牛血清购于杭州四季青公司。慢性粒细胞白血病细胞株 K562、 绒毛膜癌细胞株JEG3细胞来源于ATCC，培养于含15% 小牛血清的RPMI 1640 培养液中。 包括人HLAG1全长cDNA的真核表达质粒由Carole Ober博士惠赠。 K562细胞的转染及药物筛选 脂质体介导的真核细胞转染技术参照Lipofectamine 2000脂质体转染试剂盒说明进行。转染细胞在800 μg/ml浓度G418条件下筛选稳定株。稳定转染细胞株表示为K562HLAG1，转染空载体的细胞株表示为K562RSV。 抗体和流式细胞术 小鼠抗人HLAG1单克隆抗体(MEMG/9) 购自BioVender公司。小鼠抗人HLADR、 CD1a、ILT3、ILT4、CD80、CD86抗体，PE标记小鼠抗人CD1a抗体均购自R D公司。FITC标记山羊抗小鼠IgG抗体、山羊抗小鼠IgG免疫磁珠购自晶美公司。流式细胞术分析前，将细胞与含20%人血清的PBS作用以封闭Fc受体。并用同型对照抗体以系统性消除非特异性结合。流式细胞分析采用CellQuest软件。 外周血来源树突状细胞培养及细胞的共培养 取新鲜的人肝素抗凝外周血20 ml，用PBS 以1∶1的比例稀释后沿离心管壁缓慢加到淋巴细胞分离液上，2 000×g离心20分钟后取