绿色荧光蛋白和成肌调节因子在骨髓基质干细胞中的共表达论文.docVIP

　　绿色荧光蛋白和成肌调节因子在骨髓基质干细胞中的共表达论文 李美山，张成，陈松林，于美娟，张雅妮，王淑辉，熊符 【关键词】 腺病毒 Coexpression of both green fluorescent protein and myogenic regulatory factors in bone marroesenchymal stem cells 【Abstract】 AIM: To investigate the transfection of bone marroesenchymal stem cells (MSCs) by rebinant adenovirus (Ad), and the expressions of both green fluorescent protein (GFP) and myogenic regulatory factors, etry (FCM). AdGFP plified and identified to transfect MSCs. Expressions of both MyoD and Myogenin yoblasts, and MyoD expression munofluorescence (IF). RESULTS: FCM shoultiple of infection (MOI), transfection rate yogenic regulatory factors yogenic differentiation of MSCs. 【Keyesenchymal stem cells; adenovirus; green fluorescent protein; C2C12; MyoD; Myogenin 【摘要】 目的：研究重组腺病毒（Ad）对骨髓基质干细胞（MSCs）的转染，以及绿色荧光蛋白（GFP）和成肌调节因子MyoD和Myogenin在MSCs中的表达. 方法：用差速贴壁法体外培养大鼠MSCs.freelesenchymal stem cells, MSCs）具有向成骨、脂肪、神经以及肌肉等多种类型细胞分化的潜能，其易于分离和扩增的特性，使其成为细胞治疗的一种很有前景的治疗手段［1-3］. 为促使MSCs更好地定向分化，对其进行外源性基因修饰和/或内源性基因的激活，成为目前亟待解决的问题. 我们通过构建有绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）的５型重组腺病毒（AdGFP）转染大鼠的MSCs，并与C2C12成肌细胞共培养，通过激活内源性成肌调节因子，启动MSCs的成肌分化. 1材料和方法 1.1材料DMEM和1640培养基（Gibco公司）、胎牛血清（杭州四季青公司）、新生牛血清（Hayclone公司）、FITC荧光标记小鼠抗大鼠抗体（PharMingen and Serotec公司）、人胚肾293细胞和AdGFP（中山大学黄文林教授惠赠）、C2C12细胞（中山大学潘秋辉博士惠赠）、兔抗MyoD多克隆抗体（SantaCruz公司）、山羊抗兔cy3 IgG二抗（chemicon公司）. 健康雄性SD大鼠，清洁级，质量50~70 g，购于中山大学实验动物中心. 1.2方法 1.2.1大鼠骨髓MSCs的体外分离培养及鉴定将SD大鼠引颈处死后于无菌条件下分离出股骨和胫骨，用注射器冲出骨髓后，再经吹打制成单细胞悬液. 离心后弃上清，用加有胎牛血清（FCS）的DMEM重悬细胞，接种于培养瓶中培养2~3 d后换液. 约1~2 in，再以PBS清洗，多聚甲醛固定，流式细胞仪（FCM）检测MSCs的表面抗原. 1.2.2293细胞的培养、AdGFP的扩增、纯化、滴度的测定及鉴定将293细胞培养在含100 mL/L新生牛血清的1640中培养约48 h，细胞生长至80%融合时传代培养. 当细胞生长至90%融合时，可用于AdGFP的扩增. 弃去培养基，加入AdGFP，再加含50 mL/L新生牛血清和35 g/L精氨酸的1640培养36~48 h. 当细胞出现病变效应（cytopathic effect，CPE）时，连同培养液一同收集在离心管中，室温1000 r/min，离心5 min，弃上清，加细胞裂解液，吹打均匀后冻存，在下次应用前，应于-80/37℃反复冻融3次，然后3600 r/min离心30 min，取上清接种至293细胞. 用CsCl2梯度离心法纯化病毒，用TCID50检测方法测定纯化后的病毒滴度约为8×109国际单位（IU）. 取病变后293细胞的裂解上清，按照酚氯仿抽提方法提取病毒DNA，进行病毒基因组E2b区的PCR检测. 正义引物为5′TCGTTTCTCAGCAGCTGTTG3′， 反义引