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金属离子对核酸酶P1催化水解RNA反应的 影响及其机理探讨 郭春香 邵昌平* 郭和夫 （中国科学院大连化学物理研究所，大连 116023） 核酸酶P1(EC3.1.30)是一个具有水解核酸RNA和DNA）功能的含锌金属酶，其 水解产物是组成RNA或DNA的结构单元——四种5-核苷单磷酸或四种5-脱氧核苷 单磷酸 1（。 金属离子在一定的条件下，可能与酶、核酸或核苷酸形成配合物，从而影响酶催化 的水解核酸反应。 本文研究了外源金属离子对核酸酶P1催化水解RNA反应的影响，测定了个别金属 离子影响的动力学常数，并以ESR方法对其机理进行了探讨。 材料和试剂：核酸酶P1为日本天野制药公司的酶粉，活力为1 105u/g。经 (NH4)2SO4沉淀、SephadexG100和DEAE52柱层析提纯后，纯化倍数为4，电泳 为一条带。RNA为生化试剂。ZnCl2,MgSO4 TiCl3,CeCl3,MnCl2,FeSO4, CoC2,CuSO4和PdCl2均为试剂级。 酶活力单位定义：在一定的条件下 6（5 ，PH5.6水解RNA，每分钟生成的5-核 苷酸引起波长260nm处光密度变化一个单位所需要的酶量，定义为一个活力单位。酶活 力按文献 （2）方法测定。 外源金属离子影响的动力学实验：将一定浓度的金属盐溶液加到一定浓度的RNA 或酶的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，再加入一定浓度的酶或RNA的溶液，在一定的条件下 进行水解反应，记录动力学数据。 实验结果与讨论如下： 1．核酸酶的动力学性质：在45～?95 酶表现出活力，在78℃时活力最高。在 pH为3 7时，酶表现出活力，在pH为5 6时活力最高。按Michaelis-Menten方 程，以反应速度V与底物浓度[S]的倒数关系作图求得米氏常数Km=29.4g/L；极限反 应速度Vm=1.25g/Lmin 若以RNA的平均分子量为5 104计算，则Km=0.59mmol/ L;Vm=0.025mmol/Lmin。 2．外源金属离子的影响：Zn2+,Mg2+,Ti3+和Ce3+的影响见图1。 在浓度10-2～10-6mol/L范围内，Zn2+表现出明显的激活作用，而Mg2+几乎没有 影响。Ti3+和Ce3+在浓度大于1 10-3mol/L时，都表现了极强的抑制作用。 1990年11月5日收 。 *通讯联系人。 Mn2+,Fe2+,Co2+,Cu2+和Pd2+的影响结果见图2。 结果表明，Mn2+,Fe2+,Co2+,Cu2+和Pd2+在浓度 10-2～?10-5mol/L范围内， 都表现出明显的抑制作用。 3．Fe2+,Co2+和Cu2+抑制作用类型及其抑制常数 Ki：在不同金属离子浓度 下，测定不同浓度的RNA水解速度，以1/V对1/S]作图判断金属离子抑制作用的类 型 3（。结果显示，Fe2+,Co2+和Cu2+都表现出非竞争性可逆抑制作用。Cu2+的抑制 类型判别如图3。 由不同底物浓度下的RNA水解速度倒数 1/V）对外源金属离子浓度 Ⅰ]作图，求得 金属离子的抑制常数Ki4。Fe2+的1/V Ⅰ]关系如图4。得到：Ki(Fe2+)=16.8 mmol/L。同样地，可得出Ki(Co2+)=18.5mmol/L;Ki(Cu2+)=14.8mmol/L。 4．Cu2+与RNA及核酸酶P1作用的ESR谱：Cu2是顺磁性离子，在ESR谱上有明 显的信号。当其与RNA或核酸酶P1作用时，若仍保持二价，则仍呈现ESR信号，而 RNA和核酸酶P1皆无ESR信号。Cu2+与RNA及核酸酶P1作用的ESR谱如图5。 图中 （1为Cu2+缓冲溶液的谱， 2）为Cu2+-RNA缓冲溶液的谱， （3）为Cu2+-酶缓冲溶液的谱。在谱 2）中出现了一个新峰 g（=2.0538。 当Cu2+-RNA-酶缓冲溶液处于水解 反应条件下时，新峰逐渐消失，最后 如谱 4）。用透析方法除去 Cu2- RNA缓冲溶液中的剩余Cu2+，得到谱 （5），有一个峰，其g值与谱 2） 中的新峰g值相同。 比较图5中的ESR谱可以看出， Cu2+与酶没有发生作用，而与RNA 发生了作用。谱 （2）和 （5）中的g= 2.0538的峰，是这种作用的一个表征。Cu2+可能与RNA形成一种配合物，