酶活性测定方法.docVIP

体系一 酶和蛋白质提取 消过毒的打孔器进行伤口处理后，在每个伤口处添加50(L以下处理：（1）无菌水，对照；（2）浓度为1000(g/mlGA3；（3）浓度为1 ×104 spores/mlP. expansum孢子悬浮液；（4）浓度为1000(g/mlGA3+浓度为1 ×104 spores/mlP. expansum孢子悬浮液。处理后湿纱布覆盖并用PE塑料膜密封作保湿处理。贮藏于常温（20-25℃）下。分别在0、12、24、36和48小时取样进行测定酶活性。取样时沿伤口用刀小心切下1g果实组织，加入10 mL冷(4℃)的50 mmol/L磷酸缓冲液（PBS）内含1.33 mmol/L EDTA和1% PVPP缓冲液(pH 7.8)。研钵加入少量液氮预冷后，在冰浴中碾磨，破碎组织，然后在冷冻离心机12000rpm离心15分钟。取上清液供酶活性和蛋白质含量用。 蛋白质含量测定 试验材料和试剂：牛血清白蛋白标准溶液：准确称取100mg 牛血清白蛋白，溶于100mL 蒸馏水中，即为1 000μg／mL的原液。 8.1.2 蛋白试剂考马斯亮蓝G-250：称取100mg 考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90％乙醇中，加入85％（W／V）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1 000mL。 8.1.3 乙醇；磷酸（85％）。 试验方法：分别取牛血清白蛋白标准溶液（1000μg／mL）0,、10μL、20μL、40μL、60μL、80μL、100μL，无菌水补至100μL，加入考马斯亮蓝G-250试剂5mL，作为标准溶液； 分别取标准溶液和上清液（试验7中得到）400μL加到酶标板，以无菌水置零，测定OD595； 酶活的测定 9.1 试验材料和试剂 9.1.1 氮蓝四唑；甲硫氨酸；核黄素；过氧化氢；愈创木酚；邻苯二酚。 9.1.2 Na2HPO4-12H2O；NaH2PO4-2H2O。 9.1.3 磷酸缓冲液PBS配制 母液：0.2M Na2HPO4：称取71.6g Na2HPO4-12H2O，溶于1000ml 水； 0.2M NaH2PO4：称取31.2g NaH2PO4-2H2O，溶于1000ml 水。 按表2配制0.2M的PB（mL），最后稀释至所要的浓度 表2 不同pH值PBS的配制 pH 0.2M Na2HPO4（mL） 0.2M NaH2PO4（mL） 6.4 26.5 73.5 7.0 62 38 7.8 91.5 8.5 9.2 试验仪器 9.3.1 200μL、1000μL移液枪，eppendorf； 9.2.2 酶标仪，； 9.2.3 酶标板，JET BIOFIL 9.3 试验方法 9.3.1 超氧物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性的测定 SOD采用氮蓝四唑（nitro-blue tetrazolium，NBT）法（Beauchamp和Fridovich，1971）[6]。反应步骤为：取200μl粗提液，加入3.7 ml NBT反应液〔50mmol/LpH7.8的磷酸缓冲液（PBS）配制的含77.12μmol/L氮蓝四唑, 100μmol/LEDTA－Na2和13.37mmol/L甲硫氨酸溶液〕，在30℃下保温2分钟后加入100μl核黄素溶液（pH7.8的50mmol/L磷酸缓冲液中含80.2μmol/L 核黄素和100μmol/LEDTA－Na2），在4000Lx日光下反应20min。然后迅速测定A560。以不照光的管做空白。用酶标仪进行测定时按比例调整为总反应体积为400μL。酶活性按以下公式计算：以抑制NBT光化还原的50％为一个SOD活性单位，结果以U/mg蛋白表示。以加缓冲液代替酶液的作为对照。 SOD总活性＝(Ack－AE)×V/(Ack×0.5×W×Vt)式中， Ack为照光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；V为样品液总体积（ml）；Vt为测定时样品用量（ml）；W为样品鲜重（g）或蛋白质含量（mg）。 9.3.2 过氧化氢酶（Catalase，CAT）活性测定 CAT 活性参照Aebi (1984)[7]的方法进行测定。用酶标仪进行测定时按比例调整为总反应体积为400μL 。400 μL反应液含50 mmol/L的PBS (pH 7.0)，30 mmol/L的H2O2和50 μL粗酶液。反应从加入过氧化氢开始计时，连续测定在240 nm吸光度的降低值。酶活性定义为：一个过氧化氢酶单位相当于在规定条件下于温度25℃，pH7.0条件下1分钟分解1μmol过氧化氢所需酶量，结果以U/mg蛋白或U/g鲜重表示。 9.3.4多酚氧化酶（Polyphenoloxidase，PPO）活性的测定 PPO活性测定采用邻苯二酚法（Aquino-Bola?os和Me